中国遗传性耳聋大家系永生细胞系的建立与保存

目的建立我国遗传性耳聋大家系患者永久淋巴母细胞株以研究核基因结构对线粒体DNA突变的修饰效应。方法采用EB病毒转化外周血淋巴细胞同时加环孢霉素A法,建立该大家系永生细胞系,其中患者14例,配偶及正常同胞18例;男性17例,女性15例。结果建株成功率达到90%以上,对已建立的永生细胞株经复苏和冻存的成功率为100%。细胞染色体制备及G显带核型分析正常。结论通过建立永生细胞系保存这一具有重要研究价值的家系遗传资源,为在细胞和分子水平上进一步开展遗传性耳聋的基础研究提供了宝贵的资料。

关于当前医学遗传学教学的思考

半个世纪以来,生物学领域的理论和技术取得了令人瞩目的成就,基因组学、生物信息学、蛋白质组学和转基因技术、克隆技术以及基因芯片技术等成为生物学领域的研究热点.所有这些研究热点和生物学领域取得的成就无不对医学遗传学的发展产生巨大的推动作用.本文就当前生物学和医学遗传学的发展现状,分析了当前医学遗传学教学中存在的问题,并提出改进意见.

医学成人教育《医学遗传学》教学探讨

成人教育的任务是培养高层次的技术应用型人才。根据成人教育固有的特点和规律,本文从教学内容、教学方式、考核评估等方面就医学遗传学这门课程的教学谈几点体会。

口腔鳞状细胞癌组织中差异微小RNA/mRNA表达谱的对接研究

目的构建分析口腔鳞状细胞癌(OSCC)中差异表达的微小RNA(miRNA)和mRNA表达谱,初步预测与OSCC发生和发展相关的miRNA和mRNA。方法运用高通量深度测序技术构建miRNA和mRNA表达谱,通过Gene Ontology功能显著性富集分析预测与OSCC细胞周期、增殖、分化和凋亡相关的miRNA和mRNA。结果共发现77个miRNA和1 298个mRNA显著性差异表达,富集分析显示与OSCC细胞周期、增殖、分化和凋亡相关的miRNA共73个,且一个miRNA可调控多个mRNA。结论 OSCC中差异表达的miRNA和mRNA对OSCC的发生和发展有潜在的作用。

氨基糖甙类抗生素致聋家系线粒体基因突变的分析

目的:探讨线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)突变与非综合征性遗传性耳聋的关系,并且建立相应的基因诊断方法。方法:调查并收集2个非综合征性耳聋家系、6个散发病例及25例正常个体的外周静脉血样本,从白细胞中提取DNA,聚合酶链反应扩增mtDNA目的片段,分别用BsmAⅠ、ApaⅠ及XbaⅠ限制性内切酶检测1555G、3243G、7445G和del961Cn点突变,对相关的扩增片段进行基因测序。结果:酶切检测,两家系中全部12例的耳聋患者均为1555G点突变阳性。家系中的其他成员、6例散发病例及25例正常人均为阴性,调查的所有个体(包括患者)3243G、7445G和del961Cn点突变均为阴性。mtDNA测序:酶切显示,1555G突变阳性病例均发现(nt)1555A→G转换,3243G、7445G及del961Cn点突变阴性。结论:1555G点突变呈母系遗传;1555G点突变在母系遗传非综合征型耳聋家系中有较高的发生率,在散发型病例中发生率较低;提示1555G点突变是该类耳聋分子诊断的有用指标。

肝豆状核变性一家系的研究

目的探讨肝豆状核变性的遗传方式,并对患者进行遗传咨询,为肝豆状核变性家系或患者的诊治提供依据。方法通过调查得到一肝豆状核变性家系资料,对此家系进行系谱分析及遗传咨询。结果家系中4代19位成员中,有3例患者,家系中成员的在家系中的分布规律符合常染色体隐性遗传的典型特点。患者后代发病为低风险。患者怀孕后的产前诊断及孕期保健非常重要。结论肝豆状核变性为常染色体隐性遗传病。对患者进行遗传咨询,意义重大。

乳腺癌MCF-7细胞Alu甲基化水平的MSRE-qPCR法检测

目的:寻找简单、可靠、经济并适合大批量检测肿瘤组织标本和肿瘤细胞系中Alu甲基化水平的实验方法。方法:用对甲基化敏感的限制性内切酶联合定量PCR(methylation-sensitive restriction endonuclease digestion and quantitative PCR,MSRE-qPCR)法检测乳腺癌细胞系MCF-7中Alu序列的甲基化水平,并与常用的亚硫酸氢盐修饰结合测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)进行比较。结果:MSRE-qPCR显示Alu甲基化水平在BstUⅠ酶切位点约为33.7%,在HpaⅡ酶切位点约为56.1%,与BSP法比较,两种方法都显示BstUⅠ位点甲基化水平较低,而HpaⅡ位点甲基化水平较高,趋势一致,并提示MCF-7细胞的Alu甲基化水平明显低于正常细胞(84.6%或者更高)。结论:MSRE-qPCR法简单、可靠、经济,适合用于大批量检测Alu甲基化水平。

乳腺癌组织中p16基因变异及CpG岛甲基化状态的研究

目的探讨p16基因在乳腺癌中的纯合缺失、突变和甲基化的改变及与乳腺癌发生、发展的关系。方法采用PCR缺失分析、PCR-SSCP及甲基化敏感内切酶-PCR分析方法检测p16基因在39例乳腺癌组织变化状况,并结合临床病理资料进行分析。结果39例乳腺癌组织有6例出现p16基因纯合缺失,3例发生p16基因突变,p16基因变异频率为15.4%,5’CpG岛11例发生甲基化,甲基化率为28.2%。10例良性乳腺病组织中未发现p16基因改变和甲基化。p16基因变异频率、甲基化状态与临床分期和淋巴结转移密切相关。结论p16基因变异、甲基化是乳腺癌中常见的分子改变,它们在乳腺癌的发生、发展过程中扮演着重要的角色。

Alu序列甲基化水平与两种乳腺癌细胞系转移能力高度相关

目的探讨Alu序列甲基化与乳腺癌转移潜能的关系。方法用亚硫酸氢盐修饰联合限制性内切酶分析法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）、亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法（bisulfite sequencing，BSP）检测两株转移能力不同的乳腺癌细胞系MCF7和MDA—MB-435S中Alu甲基化状态，每个样品挑取10个克隆测序。结果MCF7和MDA—MB-435S中Alu甲基化水平均明显低于报道的正常人体细胞Alu甲基化水平，但MCF7中Alu的甲基化水平明显高于MDA-MB-435S。同时，Alu甲基化位点在基因组中分布不均匀。结论乳腺癌的转移潜能可能与Alu序列的去甲基化以及去甲基化位点的分布相关，值得进一步探讨。

微丝骨架动态参与花粉萌发的研究

利用改进的Alexphalloidin活细胞染色方法和激光共聚焦显微镜技术,观察川百合(LiliumdavidiiDuch)花粉原生质体极性形成及萌发过程中微丝骨架的列阵变化。结果表明,花粉原生质体从贮存状态,经过水合、极性形成至萌发花粉管,其微丝结构从短小的梭形体,经过形成均匀的网状结构、向细胞边缘汇集的平行排列的束状结构,逐渐变成多层连续环绕细胞的微丝束结构。用酪氨酸磷酸酶抑制剂苯胂化氧(PAO)处理花粉原生质体,在微丝的汇合处,肌动蛋白聚集成小的团块,花粉的萌发受到抑制;而利用酪氨酸磷酸激酶抑制剂genistein处理细胞,微丝结构的列阵变化与对照相似。结果说明,在川百合花粉萌发过程中,有某种酪氨酸磷酸酶参与了反应。

中国家蚕抗菌肽CBM1、CBM2的克隆和表达研究

根据所测定的中国产家蚕CBM1和CBM2cDNA序列,设计成熟肽的特异性引物,将此基因与凝血因子Ⅹa(FⅩa)的切割序列以PCR方法连接起来,克隆至pGEX-KG表达质粒中。该载体为改进的GST融合表达质粒,所携带的6个Gly有助于提高FⅩa的切割效率。克隆得到的融合载体在大肠杆菌JM109中扩增和筛选。经DNA测序,证实为含有正确序列的乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-NCBM1(pKG-FⅩa-NCBM1)、非乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-CBM1(pKG-FⅩa-CBM1)和乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-NCBM2(pKG-FⅩa-NCBM2)、非乙酰化的pGEX-KG-FⅩa-CBM2(pKG-FⅩa-CBM2)。将该载体在BL21中诱导表达,得到GST-FⅩa切割位点NCBM1、CBM1、NCBM2、CBM2等4种融合蛋白。经SDS-PAGE,考马斯亮兰染色后,Lab-Work扫描,其表达产物达到15%～20%,每升培养液平均可得20mg融合蛋白。菌体总蛋白经GST-亲和层析柱得到纯的GST-FⅩa-NCBM1、GST-FⅩa-CBM1、GST-FⅩa-NCBM2、GST-FⅩa-CBM2融合蛋白,再经FⅩa酶切后,透析过柱得到重组的NCBM1和CBM1。平板抑菌试验证明,4种融合蛋白均有明显的生物学活性,且没有显著的差异。

关于医学院校生物技术专业建设和人才培养的思考

本文论述了生物技术专业建设在医学院校中的意义和对医学科学发展的深刻影响,并就医学生物技术专业建设和人才培养提出了建议。

中国家蚕抗菌肽基因CBM1全长cDNA序列测定及其基因结构分析

用大肠杆菌感染中国家蚕(Bombyx mori)蛹,从中提取总RNA,用RT-PCR方法获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA部分片段并克隆测序,以此蚕抗菌肽基因CBM1的部分片段,设计特异性引物,用3′、5′RACE的方法,获得蚕抗菌肽基因CBM1 cDNA的全长序列;用PCR的方法,从中国家蚕蛹基因组DNA获得抗菌肽CBM1基因的700 bp、1 100 bp左右的2个片段,初步证实中国家蚕抗菌肽基因在单倍体染色体中至少存在2个拷贝。

Lims A:一个新的LIM同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析大鼠不同剪切的Lims基因。方法:应用巢式RT-PCR,以SD大鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTMXa-1T质粒,测序鉴定。结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims A,该变异剪切体编码区为1014bp,编码338个氨基酸。结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的大鼠Lims基因剪切子Lims A,为进一步探索Lims基因在增生性玻璃体视网膜病变中的功能奠定基础。

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。

Lims E:一个新的LIM同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因。方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定。结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1164bp,编码387个氨基酸。结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Lims基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础。

线粒体DNA A1555G和961 insC双重突变导致的非综合征型遗传性耳聋

目的探讨一个非综合征型遗传性耳聋大家系线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)突变类型。方法临床听力测试已明确诊断,并收集非综合征型遗传性耳聋分支家系中33人及6例散发聋患者的外周静脉血样本,从白细胞中提取DNA,聚合酶链反应扩增mtDNA目的片段,分别用BsmA、Apa及Xba限制性内切酶检测1555G、3243G和7445G点突变,对相关的扩增片段进行基因测序。结果酶切检测,家系中17例耳聋患者均为1555G点突变阳性,非母系成员及散发聋病例均为阴性。测序结果6例酶切显示1555G突变阳性病例均发现(nt)1555A→G转换和(nt)961C插入,3243G、7445G点突变阴性。结论在该非综合征型遗传性耳聋大家系中,mtDNA12SrRNA基因区域A1555G和961insC的双重突变可能共同参与了听力损害的过程。

两个非综合征型耳聋家系中线粒体DNA12SrRNA基因A827G突变

目的探讨线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)12SrRNA基因与中国人非综合征型遗传性耳聋的关系。方法对两个母系遗传性的非综合征型耳聋家系中20名成员及32例散发耳聋患者外周血DNA进行12SrRNA、tRNAser(UCN)以及GJB2基因PCR扩增,产物通过限制性片段多态性分析及基因测序,进行突变检测和分析。结果所有研究对象的基因区域均扩增成功。12SrRNA全序列测定发现两家系中所有受检的母系成员(包括12例耳聋患者)均存在nt827A→G转换,并表现为同质性突变。而非母系成员该位点序列正常。32例散发耳聋中有1例A827G突变阳性。未检测到GJB2基因、tRNAser(UCN)A7445G及12SrRNAA1555G突变。结论再次验证了mtDNA12SrRNA基因突变在母系遗传性非综合征型耳聋发病中的重要性。首次发现mtDNA12SrRNAnt827A→G转换是导致两个中国家系耳聋遗传易感性的分子基础。