医学细胞生物学教学初经历

作为医科院校一门重要的基础课程,医学细胞生物学对于医科生后续专业课的学习乃至将来的职业发展都具有极其重要的意义。完整地教授医学细胞生物学基础知识,介绍相关领域的前沿进展,发展学生的科学性思维能力,是每一个医学细胞生物学教师的重任所在。阐述如何将互动式教学、多媒体教学、案例教学、双语教学、启发式教学等方法融合到医学细胞生物学实际教学。

实时荧光PCR检测17-AAG对人RPE细胞Akt等基因表达的调控

目的:建立检测17-AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17-AAG对人RPE细胞中Akt,Raf,Hsp90,Hsp70基因表达的调控。方法:体外培养人RPE细胞株。当加入处理因素17-AAG并作用不同浓度及时间梯度后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据Akt,Raf,Hsp90,Hsp70的基因序列,设计Akt1,Raf1,Hsp90,Hsp70的引物,利用ABI 7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct进行基因表达的相对定量分析。结果:熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17-AAG可以下调Akt及Raf基因的表达,上调Hsp90及Hsp70基因表达。结论:应用SYBR Green实时荧光PCR可以特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17-AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件。

17-AAG对人RPE细胞PDGFR和EGFR基因表达的调控

目的:通过检测17-AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17-AAG对人RPE细胞中PDGFR和EGFR基因表达的调控。方法:体外培养人RPE细胞株。当加入17-AAG并作用0,2,5,10μmol/L及0,16,24,48h后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据PDGFR、EGFR的基因序列,设计PDGFR、EGFR的引物,利用ABI7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct值进行基因表达的相对定量分析。结果:熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17-AAG可以下调PDGFR基因的表达(P<0.05),上调EGFR基因表达(P<0.05)。结论:SYBR Green实时荧光PCR可特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17-AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件。

环境类雌激素双酚A通过上调Snail蛋白表达促进MCF-7乳腺癌细胞迁移

目的:探讨外源性双酚A(BPA)调控MCF-7乳腺癌细胞迁移的分子机制。方法:通过划痕实验和Transwell实验检测MCF-7乳腺癌细胞迁移能力,并以黏附实验反向辅助验证;通过质粒转染干扰Snail蛋白表达水平,进一步研究外源性BPA调控MCF-7乳腺癌细胞迁移的分子机制。结果:外源性BPA能上调细胞中Snail的表达水平,从而下调E-cadherin的表达并促进MCF-7乳腺癌细胞迁移;siRNA干扰Snail表达后MCF-7乳腺癌细胞迁移减慢。此外,BPA刺激能降低MCF-7乳腺癌细胞黏附能力。结论:外源性BPA可通过上调Snail表达水平,促进MCF-7乳腺癌细胞的迁移,为进一步阐明乳腺癌细胞侵袭与转移的分子调控机制提供了新线索。

mbr-FPGS高效表达质粒增强Jurkat细胞对甲氨蝶呤的敏感性

叶酰多聚谷氨酸盐合成酶(Folylpolyglutamate synthetase,FPGS)是将化疗药物甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)转化成甲氨蝶呤多聚谷氨酸盐(MTXPG)的关键酶,其表达水平直接影响肿瘤细胞对MTX敏感性。与B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)相比,T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞中FPGS表达水平低,因此对MTX不敏感。本实验室前期研究证实,位于BCL2基因3′-UTR区的一段长279 bp的DNA序列mbr具有显著的增强子效应。文章构建了含有mbr增强子样序列的FPGS表达质粒,用其转染Jurkat细胞后,分别以Westernblotting和MTT法检测FPGS表达水平及MTX对肿瘤细胞的抑制率。结果表明mbr能够显著提高FPGS表达质粒的表达水平,并有效增强Jurkat细胞对MTX的敏感性。这一结果为将基础研究结果应用于临床、提高MTX对T-ALL细胞的化疗疗效提供了新的思路。

细胞凋亡反应中NOXA基因启动子发挥增强子功能调节BCL2基因表达

真核生物基因的转录受到近端启动子和远端增强子的共同调控,部分基因的启动子可兼具有增强子的活性。NOXA与BCL2分别是BCL2蛋白家族促凋亡和抗凋亡成员。本课题组前期研究发现,NOXA基因启动子与BCL2基因启动子在染色质三维空间结构上存在相互作用,且NOXA基因启动子区兼有启动子和增强子特征性的组蛋白修饰标记。为进一步探究NOXA启动子是否具有增强子活性、能否在细胞凋亡过程中作为增强子调控BCL2基因表达,本研究利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture,3C)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和荧光素酶报告基因等检测技术在喜树碱诱导的MCF-7细胞凋亡模型中证实,NOXA启动子兼具增强子活性,并可通过形成染色质环结构远程调控BCL2基因表达。NOXA启动子的调控属性与凋亡信号强弱密切相关,在较弱凋亡信号刺激下(1μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子主要发挥增强子功能;随着凋亡刺激信号的加强(10μmol/L喜树碱处理),NOXA启动子活性增强,主要调控其基因自身的表达,促进细胞凋亡。染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)证实NOXA启动子区启动子活性和增强子活性的动态变化与其组蛋白修饰标志一致。本研究为进一步探讨BCL2家族成员对细胞凋亡刺激做出协同反应的机制提供了新的线索。

JWA基因对肿瘤细胞P-糖蛋白的表达及其功能的影响

目的:研究JWA基因(又称ARL6IP5基因,ADP-ribosylation-like factor 6 interacting protein 5)对肿瘤细胞P-糖蛋白表达及其功能的影响。方法:利用脂质体转染技术将JWA-shRNA重组质粒及其空载质粒转入人绒毛膜癌细胞JAR和人乳腺癌细胞MCF-7,将Flag-JWA重组质粒及其空载质粒转入人绒毛膜癌耐依托泊苷(etoposide,VP16)JAR/VP16细胞;Westernblotting检测JWA和P-糖蛋白的表达,流式细胞术分析细胞内罗丹明123(Rhodamine 123,Rh123)的潴留情况。结果:JWA-shRNA重组质粒转入JAR细胞和MCF-7细胞后,JWA表达水平降低,P-糖蛋白表达水平上调,罗丹明潴留减少;Flag-JWA重组质粒转入JAR/VP16细胞后,JWA表达水平上调,P-糖蛋白表达水平下降,罗丹明潴留增加。结论:JWA基因可以调控肿瘤细胞P-糖蛋白的表达,并影响其转运功能。

氯氮平对斑马鱼心脏发育的影响及机制研究

目的:探索氯氮平(clozapine,CLP)对斑马鱼心脏发育的损伤效应及相关机制。方法:以12.5μmol/L氯氮平(L⁃CLP)及25.0μmol/L氯氮平(H⁃CLP)处理斑马鱼胚胎72 h,显微镜下检测心脏形态、心率、静脉窦⁃动脉球(sinus venosus⁃bulbus arteriosus,SV⁃BA)距离等指标;实时荧光定量聚合酶链反应(RT⁃PCR)检测心脏发育相关基因NKX2.5、Hand2及Cmlc2表达;此外,H⁃CLP组处理24 h后,利用内质网抑制剂4⁃苯基丁酸(4⁃phenylbutyric acid,4⁃PBA)或多巴胺D2受体抑制剂溴隐亭(bro⁃mocriptine,BRC)联合处理48 h后,统计心脏功能指标,检测内质网应激分子(Chop、Bip)及凋亡相关分子(Caspase3、Bax/Bcl2)的表达。结果:CLP剂量依赖性导致斑马鱼心脏结构及功能损伤,Chop、Bip和Caspase3、Bax/Bcl2的表达增加;4⁃PBA及BRC显著缓解CLP诱导的心脏损伤及Chop、Bip、Caspase3、Bax/Bcl2的高表达。结论:CLP导致斑马鱼心脏发育受损,可能与抑制多巴胺D2受体、激发内质网应激有关。

糖尿病胃轻瘫的诊断及发病机制

目的:探讨糖尿病胃轻瘫的早期诊断方法并探讨其可能的发病机制.方法:糖尿病住院患者38例,采用生化及放射免疫方法检测血糖、糖化血红蛋白、胃动素、胃泌素、胰高血糖素水平.以患者卧立位肱动脉收缩压变化检查植物神经功能;并采用标准餐加服小钡条试验,记录排空时间,以胃排空时间>6h诊断为胃轻瘫.结果:糖尿病胃排空异常者与胃排空正常者相比其空腹血糖(12.53±4.13mmol/L vs 7.12±1.37mmol/L,P<0.01)、餐后血糖(19.79±5.69mmol/L vs 14.11±4.21mmol/L,P<0.05)及糖化血红蛋白(9.73%±2.39% vs 7.26%±1.96%,P<0.05)明显升高,同时具有高水平的血清胃动素、胃泌素及胰高血糖素.糖尿病胃排空异常者植物神经功能异常发生率为62%(13/21),而糖尿病胃排空正常者为24%(4/17),糖尿病胃排空异常者胃内小钡条排空时间较正常者明显延长(7.93±1.23h vs 4.35±1.01h,P<0.001).结论:采用临床症状评分、血糖及胃肠道激素等监测及影象学检查可诊断糖尿病胃轻瘫,糖尿病胃轻瘫与神经病变、高血糖、血清胃肠激素异常、微血管病变及代谢紊乱有关.

科学型医学研究生科研能力的培养

科学型医学研究生教育主要以培养学生科研能力为目的,学生毕业后将从事基础医学研究的相关工作。就医学院校研究生科研能力的培养提出一些看法和思路,旨在探讨如何提高医学学科研究生培养的途径与方法,使其更加适应社会发展与医学模式转变的需要。

DNMT3a通过提升基因内部甲基化介导紫杉醇诱导的LINE-1异常表达

药物诱导的长散在重复序列LINE-1异常激活可促进细胞基因组不稳定,而基因组不稳定是促进肿瘤发生发展和耐药表型形成的重要因素。因此,探索LINE-1异常激活的分子机制具有重要的理论和临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的重要方式,已知DNA甲基转移酶家族成员DNMT3a不仅能通过促进基因启动子甲基化抑制基因表达,还可通过增强基因内部甲基化上调基因表达。本实验室前期研究发现,将乳腺癌细胞暴露于化疗药物可诱导LINE-1异常高表达,但LINE-1启动子甲基化水平并无显著改变。本研究进一步探讨了在化疗药物压力下DNMT3a是否可通过增强LINE-1基因内部甲基化水平促进LINE-1在乳腺癌细胞中的异常高表达。ChIP实验和甲基分析结果显示,用化疗药物紫杉醇(PTX)处理乳腺癌细胞,不仅可以诱导DNMT3a表达,而且可以促进DNMT3a与LINE-1基因内部区域的结合,提升其基因内部甲基化水平,进而上调LINE-1的表达水平。利用表达载体增加细胞内DNMT3a的表达水平,可显著上调LINE-1基因内部的甲基化及基因的表达水平,而下调DNMT3a的表达可有效抑制LINE-1表达。上述研究结果表明,DNMT3a介导的基因非启动子区甲基化在药物诱导的LINE-1异常激活中发挥重要作用,为认识LINE-1在乳腺癌化疗耐药性形成过程中异常激活的机制提供了新思路。

人锌转运体8嵌合抗原受体表达载体的构建与初步应用

目的:构建人锌转运体8(zinc transporter 8,ZnT8)嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的慢病毒表达载体,为研究抗原特异性调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)在1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)自身免疫中的调节作用提供实验基础。方法:通过分子克隆及基因重组技术构建PLVX-EGFP-ZnT8 scfv慢病毒表达载体质粒,并制备ZnT8 scfvCAR慢病毒;利用ZnT8 scfv-CAR慢病毒感染Tregs,流式细胞术检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达确定慢病毒感染效率;细胞计数评估Tregs细胞增殖能力;流式细胞术检测增殖细胞中CD4、CD25、Foxp3和Helios的表达。结果:酶切鉴定和基因测序结果显示PLVX-EGFP-ZnT8 scfv慢病毒表达载体构建成功;质粒共转染293T细胞后制备浓缩慢病毒滴度为2.4×10^8TU/μL;ZnT8 scfv-CAR慢病毒转染Tregs后GFP表达率为43.2%±4.1%;体外培养14 d后ZnT8特异性Tregs增殖(634.3±92.5)倍,且高表达Foxp3(60.4%±3.5%)和Helios(64.3%±4.8%)。结论:成功构建了包含CAR结构的PLVX-EGFP-ZnT8 scfv慢病毒载体并包被ZnT8 scfv-CAR慢病毒;慢病毒转染后的CAR-Tregs体外扩增14 d仍能够维持ZnT8-CAR结构表达;CARTregs为一群CD4^+CD25^+细胞且高表达Foxp3和Helios。

间隙连接蛋白43与缺血性心律失常的关系进展

缺血性心律失常是急性心肌梗死致死的主要原因之一。间隙连接蛋白(Cx)43是心室肌的主要连接蛋白,在梗死后其表达分布的紊乱与缺血性的心律失常及心脏功能的恢复有着密切联系。研究发现心肌核因子(NF)-κB、蛋白激酶(PK)A、PKC、等多种信号通路通过调节Cx43水平来发挥抗心律失常作用。Cx43转基因细胞移植技术,也表现出良好的抗心律失常和心功能恢复的效果。故本文将对Cx43与心肌梗死后心律失常关系及心功能恢复的进展作一综述。

人、鼠原肠形成蛋白基因的克隆和初步分析

目的:分析原肠形成蛋白(TSG)在几个发育阶段的人和小鼠睾丸中的差异表达。方法:应用cDNA微阵列技术对成人和胚胎睾丸进行基因表达图谱分析,获得在成人高表达、胚胎低表达的人TSG的全长基因;利用RT-PCR,从4周龄小鼠睾丸中克隆出小鼠TSG基因,用地高辛标记的探针进行原位杂交,检测小鼠TSG在睾丸中的表达。结果:人TSG在成人睾丸中高表达,在胚胎中低表达;小鼠TSG仅在小鼠睾丸生殖细胞中表达,在间质细胞中不表达。结论:小鼠睾丸TSG与骨形态发生蛋白(BMP)可能同步表达,提示在小鼠精子发生中也可能存在一条由TSG信号激活BMP的传导途径。

CDP参与凋亡过程中远程调控元件mbr对于凋亡相关基因的转录调控作用

目的研究凋亡过程中SATB1降解后,CDP能否代替SATB1参与BCL2和NOXA的转录。方法在Jurkat细胞中过表达CDP,Real-time PCR检测BCL2和NOXA的转录。EMSA检测mbr元件和NOXA-SBS1上蛋白复合物的变化。结果在Jurkat细胞中,mbr元件和NOXA-SBS1上均存在SATB1蛋白,当SATB1和CDP比例改变后,mbr元件上SATB1蛋白复合物消失,取而代之的是CDP蛋白复合物。CDP可以促进NOXA的转录,抑制BCL2的转录。结论 SATB1与其同源异型蛋白CDP的比例变化可直接改变mbr增强子上蛋白复合物的组成。

Prkdc和Il2rg双敲除免疫缺陷小鼠的构建和初步应用

目的:构建NOD背景免疫缺陷小鼠,作为新的人源肿瘤异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型。方法:利用CRISPR/Cas9技术获得NOD背景Prkdc和Il2rg双基因敲除小鼠,通过正常繁育得到能够稳定遗传的纯合子后代(命名为NYG小鼠),流式细胞术检测小鼠外周血免疫细胞比例,移植接种新鲜肿瘤组织,观察记录肿瘤生长状况及HE染色观察传代PDX肿瘤形态学特点。结果:NYG小鼠外周血小鼠无成熟的T细胞、B细胞和NK细胞表达,对移植的患者肿瘤组织几乎没有排斥反应,组织病理学表型及免疫系统未见明显异常。结论:成功构建NYG小鼠免疫缺陷小鼠,为肿瘤学基础理论及应用研究提供了新的PDX动物模型。

帕博西尼和厄洛替尼联合治疗结直肠癌的协同作用及其机制

目的:评估帕博西尼(Palbociclib)单独或联合表皮生长因子缀体抑制剂厄洛替尼(Erlotinib)治疗结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的有效性。方法:采用Alamar blue法和克隆形成实验检测帕博西尼单独或联合厄洛替尼对CRC细胞系增殖的影响;采用DNA含量定量法检测细胞周期分布变化;分别通过β-半乳糖苷酶和DCFH-DA染色检测细胞衰老和活性氧积累的情况;通过Western blot分析相关蛋白表达水平;在CRC患者来源异种移植模型中检测联合治疗的效果。结果:帕博西尼单独治疗有效抑制CRC细胞增殖,诱导细胞G1期阻滞、细胞衰老和胞内活性氧积累。帕博西尼和厄洛替尼联合治疗CRC具有协同作用,厄洛替尼进一步增强帕博西尼对CRC的多种抑制效应和多信号通路抑制,在CRC患者来源的异种移植模型中显示出了良好的协同抑制作用。结论:帕博西尼联合厄洛替尼在体外和体内能够协同抑制结直肠癌的生长。

TNFRSF19过表达抑制肺癌细胞增殖及锚定非依赖生长能力

目的观察肺癌细胞中TNFRSF19对增殖及锚定非依赖生长能力的影响。方法将TNFRSF19连接至pLVX-EF1A慢病毒载体中,构建过表达质粒,收取慢病毒上清;感染人肺癌细胞系A549细胞后通过Western印迹实验检测TNFRSFL9表达水平的改变;通过MTT实验、平板克隆形成及肿瘤成球实验观察TNFRSF19在肺癌细胞中对增殖及锚定非依赖生长能力的影响。结果成功构建TNFRSF19慢病毒过表达质粒,并建立TNFRSF19过表达的A549细胞系。实验结果显示过表达TNFRSF19可抑制肺癌细胞增殖及锚定非依赖生长能力。结论TNFRSF19可能是一个潜在的抑癌基因,在肺癌发展过程中可能存在保护性作用。

筛选MDA-MB-231乳腺癌耐药细胞株两种方法的比较

目的 比较间歇刺激法和浓度梯度递增法对雌激素受体（estrogen receptor,ER）阴性的乳腺癌耐药细胞株的建立,为进一步探讨ER阴性乳腺癌可能的耐药机制.方法 采用间歇刺激法和浓度梯度递增法,用紫杉醇诱导6个月,分别建立了耐药细胞系231 TIM10和231 TAX8,并用倒置相差显微镜、MTT法、Western印迹、流式细胞术比较了两株耐药细胞的形态学变化、耐药表型、ER-α蛋白表达及紫杉醇诱导细胞G2/M期阻滞效应的改变等生物学特性.结果 间歇刺激法比浓度梯度递增法更容易诱导ER阴性的乳腺癌细胞获得耐药表型,231 TIM10耐药指数为11.9,231 TAX8耐药指数为2.3.用紫杉醇处理后,231 TIM10细胞能够抵抗100 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应,231 TAX8细胞仅能够抵抗10 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应.231 TIM10细胞在诱导过程中形成了两个细胞亚群,体积增大明显,细胞之间黏连更加明显.MDA-MB-231敏感细胞和两株耐药细胞均无ER-α蛋白的表达.结论 间歇刺激法更合理地模拟了临床上ER阴性乳腺癌的耐药过程,建立了可靠的细胞耐药模型,为耐药机制研究建立了基础.

利用CRISPR/Cas9技术构建22q-Enh3增强子元件敲除型A549稳定细胞系

目的 增强子元件敲除细胞系是探索增强子功能的理想细胞模型,为了探索位于22q12.2肺癌易感染色质区的增强子元件22q-Enh3的生物学功能,建立敲除22q-Enh3增强子元件的纯合细胞系.方法 利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr-associated 9）基因敲除技术在非小细胞肺癌A549细胞系中敲除22q-Enh3增强子,并运用流式细胞术、细胞培养以及PCR技术筛选和鉴定敲除型克隆.结果 我们最终获得了3个敲除增强子元件22q-Enh3的纯合子细胞克隆.结论 本研究为进一步研究22q-Enh3增强子元件的生物学功能提供了细胞模型,并为应用CRISPR/Cas9基因敲除技术建立其他增强子元件敲除型纯合子细胞模型积累了宝贵经验.