nNOS参与OGD介导的促神经干细胞增殖效应

目的:体外研究脑缺血促神经发生的机制。方法:体外培养神经干细胞(neural stem cells,NSCs)与海马神经元,并采用氧糖剥夺模型(oxygen and glucose deprivation,OGD)模拟在体缺血,通过RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学、酶活性测定、亚硝酸盐/硝酸盐(nitrite/nitrate,NOx)含量测定等多种方法研究神经干细胞的生物学行为以及介导这种效应的分子机制。结果:(1)OGD通过直接和间接(神经元)作用增加神经干细胞中BrdU+细胞比例。(2)OGD上调神经干细胞中神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)并下调神经元中nNOS,且都有利于神经干细胞增殖。(3)采用nNOS基因敲除小鼠来源的神经干细胞以及神经元(用于共培养)进行实验,发现OGD并不能升高神经干细胞中BrdU+细胞比例。结论:神经干细胞和神经元中nNOS水平变化共同参与了OGD诱导的促神经干细胞增殖效应。

牛磺酸对氧化应激损伤的神经保护作用

目的:探讨牛磺酸对过氧化氢(H2O2)引起的神经元损伤的保护作用。方法:采用不同浓度的H2O2处理神经元,制备体外氧化应激模型,造模前24 h分别给予5、15、25 mmol/L牛磺酸预处理。采用特异性荧光探针DCFH-DA检测神经元活性氧自由基水平,检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率反映神经元损伤程度,用免疫印迹法检测脑源性营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及突触相关蛋白的表达水平。结果:与Control组比较,不同浓度的H2O2(25、50、100μmol/L)均能使LDH向胞外释放增多(P<0.05),15、25 mmol/L的牛磺酸均能减少H2O2引起的LDH的释放(P<0.05)。100μmol/L H2O2使神经元胞内活性氧水平升高,仅25 mmol/L的牛磺酸能抑制H2O2诱导的胞内活性氧的增多(P<0.05)。100μmol/L H2O2处理神经元导致BDNF、突触相关蛋白Synapsin和Spinophilin表达水平下降,给予25 mmol/L的牛磺酸能部分逆转H2O2诱导的蛋白水平的下降(P<0.05)。结论:牛磺酸能够减轻H2O2引起的神经元损伤,具有较好的神经保护作用。

氧糖剥夺引起MF-CA3通路突触传递LTD现象及其机制研究

目的 ：观察氧糖剥夺引起的MF-CA3通路突触传递的长时程抑制（long-term depression,LTD）现象,并探讨其分子机制。方法：选择出生后2~3周的Sprague Dawley（SD）乳大鼠,制备海马脑片,通过刺激苔藓纤维,采用膜片钳的方法记录突触后电流。氧糖剥夺15 min后,观察突触传递的变化情况。分别采用犬尿喹啉酸阻断α-氨基羟甲基恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid,AMPA）受体、LY341495阻断代谢型谷氨酸受体﹑BAPTA螯合细胞内钙离子,观察对LTD的可能影响。结果：1氧糖剥夺15 min能引起MF-CA3通路AMPA受体介导的突触电流减弱,产生LTD现象;2若氧糖剥夺过程中运用阻断剂阻断AMPA受体的激活,洗脱后并不影响LTD的产生,而阻断代谢型谷氨酸受体可以使AMPA受体电流的LTD现象消失;3除去外液中的钙离子或用BAPTA螯合细胞内的钙离子均能使LTD现象消失。结论：氧糖剥夺引起MF-CA3通路上AMPA受体介导的突触电流持续减弱,呈现LTD现象。这种LTD现象依赖于代谢型谷氨酸受体的激活及胞内外钙离子浓度升高,但不依赖氧糖剥夺过程中AMPA受体的激活。

脑卒中前敲减HDAC2改善光照脑缺血模型小鼠的行为学缺陷

目的:探讨脑卒中前蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)对于光诱导血栓形成性脑缺血模型小鼠行为学缺陷的作用。方法:通过微量给药系统将腺相关病毒AAV-CAG-EGFP-Cre(2μL)注射至HDAC2flox/flox鼠的运动皮层用以敲减HDAC2,通过免疫荧光以及免疫印迹(Western blot)分析确证病毒AAV-CAG-EGFP-Cre与对照病毒AAV-CAG-EGFP的表达。7 d后进行光诱导血栓形成性脑缺血造模,并于造模前第3天以及造模后第8天采用网格实验和圆筒实验分别检测造模前后AAV-CAG-EGFP-Cre组与AAV-CAG-EGFP组行为学的改变。结果:病毒AAV-CAG-EGFP-Cre相较于对照AAV-CAG-EGFP能特异性地敲减HDAC2,免疫荧光表现为GFP与HDAC2双阳性细胞数减少,Western blot显示针孔周围区HDAC2表达水平降低(P<0.05)。脑缺血前后的行为学检测表明病毒干预后,HDAC2的下调对缺血前行为学无影响,但显著降低了脑缺血后网格实验的失足率(P<0.001)与圆筒实验的不对称指数(P<0.001),促进了行为学改善。结论:脑卒中前通过重组病毒敲减HDAC2,可以改善脑卒中后小鼠行为学缺陷。