三种脊髓性肌萎缩症携带者筛查方法的性能评估

目的:比较3种分子遗传技术在脊髓性肌萎缩症基因携带者筛查检测中的检测性能。方法:采用微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)与多重竞争性PCR联合毛细管电泳(PCR-based capillary electrophoresis,PCR/CE)技术检测516例样本中SMN基因拷贝数,并通过多重连接依赖探针扩增(multiple ligationdependent probe amplification,MLPA)方法作为金标准技术验证结果。结果:ddPCR、HRM和PCR/CE检测SMN1第7号外显子的拷贝数与MLPA分析结果一致,灵敏度和特异度均为100.0%。HRM检测SMN1基因第8号外显子单拷贝的灵敏度和特异度为100.0%和99.5%,双拷贝的灵敏度和特异度为99.4%和100.0%,而大于双拷贝的灵敏度和特异度为100.0%和100.0%。PCR/CE可以同时检测SMN1和SMN2基因的第7、8号外显子,检测结果与MLPA结果完全一致,灵敏度和特异度均为100.0%。结论:本研究比较了3种分子遗传技术在SMA携带者筛查检测中的效能,为建立大规模人群的脊肌萎缩症携带者筛查技术选择提供依据。

基于毛细管电泳的单基因病扩展性携带者筛查技术的建立及临床评估

目的建立并评估一种基于毛细管电泳技术的单基因病扩展性携带者筛查方法.方法采用多个基于毛细管电泳的技术检测1099例样本中24个基因相关的20种疾病中的448个致病变异并进行验证.结果毛细管电泳检测结果与其他方法验证的结果完全一致.在1099例受检者中,检出190例携带者,总体携带率为17.3%(190/1099),检出变异个数最多的是GJB2基因.在检测的1075例女性样本中,共检出8例为X连锁遗传病致病基因的携带者,携带率为7.4‰(8/1075).结论成功建立了一种基于毛细管电泳的扩展性携带者筛查技术.

南京地区175767例串联质谱技术新生儿筛查结果分析

目的分析南京地区新生儿遗传代谢病的检出情况。方法分析2013年12月至2018年7月南京市出生的175767例串联质谱新生儿筛查的结果。采用非衍生化串联质谱技术检测干血滤纸片氨基酸、酰基肉碱和琥珀酰丙酮浓度,筛查新生儿氨基酸、有机酸和脂肪酸等三大类遗传代谢病。对于筛查阳性的患儿,通过基于高通量测序技术的基因Panel检测致病基因突变。对数据采用描述性统计学方法进行分析。结果175767例新生儿筛查初筛阳性率为2.1%(3691/175767),3691例初筛阳性中召回3598例,最终临床诊断遗传代谢病患儿62例,包括氨基酸代谢病35例、有机酸代谢病12例、脂肪酸代谢病15例。本地区新生儿遗传代谢病的总发病率为0.0353%,其中氨基酸代谢病、有机酸代谢病和脂肪酸代谢病的总发病率分别为0.0199%、0.0068%和0.0085%。发病率最高的疾病分别为苯丙氨酸羟化酶缺乏症0.0159%、甲基丙二酸血症0.0051%和原发性肉碱缺乏症0.0051%。62例临床诊断为遗传代谢病的患儿中,51例(82.2%,包括17例苯丙氨酸羟化酶缺乏症和34例其他遗传代谢病)进行了基因诊断(另外11例苯丙氨酸羟化酶缺乏症患儿拒绝进行基因诊断)。17例苯丙氨酸羟化酶缺乏症患儿均找到2个致病突变,分别来自于父母。34例其他遗传代谢病患儿中29例找到2个致病突变,分别来自于父母;另5例患儿仅找到1个致病突变,其中2例高甲硫氨酸血症为常染色体显性遗传。结论本地区发病率较高的新生儿遗传代谢病为苯丙氨酸羟化酶缺乏症、甲基丙二酸血症和原发性肉碱缺乏症。串联质谱筛查出的部分病例仅表现为筛查指标异常,随访中尚未出现特异性临床症状,需要进行更长期的随访。

江苏地区5776例孕妇脊髓性肌萎缩症携带者筛查及产前诊断

目的对江苏地区5776例孕妇进行脊髓性肌萎缩症(SMA)的携带者筛查,确定本地区SMA的携带频率,通过对高风险胎儿进行产前诊断,减少SMA患儿的出生。方法荧光定量PCR法检测SMN1基因第7和第8外显子的拷贝数,筛查SMA携带者,并通过多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)对高风险胎儿进行产前诊断。结果对16549例孕妇进行SMA携带者筛查的宣教,其中5776例孕妇自愿接受携带者筛查,接受率约为34.9%。5776例孕妇中,共筛查到100例孕妇(100/5776,1.73%)携带SMN1基因E7单拷贝或E7和E8单拷贝,其中E7和E8单拷贝的孕妇有93例,单纯E7单拷贝有7例,携带者频率为1∶58。经遗传咨询,100例携带者中,91例配偶(91/100,91%)接受SMA筛查,结果提示3对夫妇同时为SMA携带者,并且对3例高风险胎儿进行了产前诊断,最终提示这3个胎儿均为SMN1基因单拷贝,即SMA携带者。结论荧光定量PCR技术适用于大样本量的人群携带者筛查,确定了江苏地区人群的SMA携带频率,并且对于高风险胎儿进行产前诊断,避免SMA患儿的出生,对出生缺陷的防控具有重要的临床意义。

甲基丙二酸血症家系的基因诊断与产前诊断

目的:通过对35例甲基丙二酸血症家系进行基因检测,明确基因突变类型,并对高风险胎儿进行产前诊断,减少甲基丙二酸血症患儿的出生。方法:应用高通量测序技术检测甲基丙二酸血症相关基因(MUT、MCEE、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、LMBRD1、ABCD4、HCFC1、GPHN、PCCA及PCCB),确定家系基因型,并通过Sanger测序对高风险胎儿进行产前诊断。结果:35例甲基丙二酸血症家系中,有30例为MMACHC基因突变导致的cblC型MMA,共检测出12种突变,其中c.79C>T为新变异;5例为MUT基因突变所致的单纯型MMA,共检测出9种突变,其中c.577A>T、c.1591delG、c.1610T>A及c.2216_2219del为新突变。对8个家系的高风险胎儿进行相应突变位点的产前诊断,其中与先证者基因型一致的胎儿,家庭均选择终止妊娠,对野生型和仅携带一个突变位点的胎儿继续妊娠,随访后均发育正常。结论:通过对35例甲基丙二酸血症家系的高通量测序,发现5种新突变,通过基因诊断和产前诊断可有效防止甲基丙二酸血症患儿的出生,并为本地区后续基因筛查、遗传咨询提供依据。

10q22.3q23.3微缺失综合征合并高甲硫氨酸血症1例报告并文献复习

目的探讨10q22.3q23.3微缺失综合征合并高甲硫氨酸血症的临床特征。方法回顾分析1例10q22.3q23.3微缺失综合征合并高甲硫氨酸血症患儿的临床资料。结果患儿,男,特殊面容,额突出,鼻根低,眼距宽,内眦赘皮,鼻头轻度上翘,人中浅,耳位低,余未见特殊异常。患儿于出生后72小时行串联质谱检测,蛋氨酸(MET)306.02μmol/L,召回复查MET升至695.37μmol/L。家系验证分析显示,患儿父亲为10q22.3q23.2微缺失综合征,其缺失性CNV为自发变异(de novo),患儿母亲携带MAT1A基因c.74_75delTG(p.Val 25GlyfsX7)杂合变异。患儿最终确诊基因型为10q22.3q23.2 deletion/c.74_75delTG(p.Val25GlyfsX7),为10q22.3q23.3微缺失综合征合并高甲硫氨酸血症。确诊后患儿给予低蛋氨酸饮食联合康复训练,但患儿家属依从性差,MET控制在700μmol/L左右,肝功能无异常,大运动发育无异常,语言发育迟缓。结论报道1例10q22.3q23.3微缺失综合征合并高甲硫氨酸血症病例。10q22.3q23.3微缺失综合征外显不全,预后差异较大;MET超过600μmol/L需尽早予以低蛋氨酸饮食治疗。

应用多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术进行脊髓性肌萎缩症携带者筛查

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传、儿童致死性神经系统疾病。SMA致病基因为运动神经元存活基因(survival motor neuron1,SMN1)。虽然检测SMN1基因拷贝数的方法众多,但目前适于大规模人群筛查的技术较少。为寻求一种快速准确的实验技术可以用于人群中SMA携带者的大规模筛查,了解区域人群携带情况及常见变异的分布,本研究应用多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术检测12例SMA患者及其父母SMN1基因拷贝数,同时对江苏地区151例健康孕妇人群SMN1基因进行拷贝数检测,并通过多重连接依赖探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)技术验证检测结果。多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术结果与MLPA结果一致,显示12例SMA患者均为SMN1基因零拷贝,其父母的SMN1基因拷贝数均为单拷贝,151例健康人群中检测出SMN1基因单拷贝3例(即SMA携带者),占2.0%;SMN1基因双拷贝134例,占88.7%;SMN1基因大于双拷贝14例,占9.3%。因此,多重竞争性PCR联合毛细管电泳技术作为一种快速、简便和准确的检测技术具有着应用于人群中SMA携带者的大规模筛查的潜力。

南京地区1987~2019年新生儿先天性甲状腺功能减低症筛查回顾分析

目的回顾分析南京地区新生儿先天性甲状腺功能减低症筛查情况。方法选择1987年1月~2019年12月出生的1325810例新生儿,于出生48-72h充分哺乳后采集足跟血,制成干血滤纸片,先后采用放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA;1987年1月~1993年8月)、时间分辨荧光免疫法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA;1993年9月至今)检测促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH),可疑阳性患儿召回检测甲状腺功能,确诊患儿给予规范治疗并定期随访。结果1325810例新生儿中确诊先天性甲状腺功能减低症、高TSH血症共664例,统计发病率为1/1997。早产患儿中永久性甲减者较多,体重、分娩方式与患儿预后没有明显相关性。结论新生儿筛查可早期发现先天性甲状腺功能减低症,早期诊断和规范治疗有助于改善患儿预后。

苯丙氨酸羟化酶基因c.158G>A变异的致病性及基因型-表型相关性分析

目的探讨苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺乏症相关的PAH基因c.158G>A变异的致病性以及与表型的相关性。方法回顾分析2016年7月至2021年6月南京医科大学附属妇产医院确诊的37例PAH缺乏症患儿的临床资料和基因检测结果。结果在37例患儿中,轻度高苯丙氨酸血症(HPA)共34例,其中33例检测到2处PAH变异(包括c.158G>A)且均为复合杂合子,1例检测到3处PAH变异,包括c.158G>A纯合变异及c.842+2T>A杂合变异。3人为经典型苯丙酮尿症(PKU),并携带3处PAH变异,在其中2例中c.158G>A与c.842+2T>A呈顺式排列,基因型为c.[158G>A,842+2T>A]/c.728G>A和c.[158G>A,842+2T>A]/c.611A>G,在另1例中158G>A与c.722G>A呈顺式排列,基因型为c.[158G>A,c.722G>A]/c.728G>A。其中,c.158G>A变异对PAH的活性影响较小,与轻度HPA表型相关,可归类为"可能良性"变异,但患者的临床表型还与另一等位基因的变异类型有关。结论37例PAH缺乏症患儿遗传学研究提示,c.158G>A变异与其他致病变异呈顺式排列时,患者的临床表型主要取决于其余2个变异的致病性。

C14∶1/C12∶1在新生儿筛查极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症中的应用价值

目的探讨非衍生化串联质谱法(MS/MS)中十四烯酰基肉碱(C14∶1)/十二烯酰基肉碱(C12∶1)在新生儿筛查极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(VLCADD)中的应用价值,并探索筛查VLCADD的最佳指标组合方案。方法回顾性分析2014年1月至2021年12月南京市新生儿疾病筛查中心和苏州市新生儿疾病筛查中心17例MS/MS筛查发现并经酰基辅酶A脱氢酶极长链(ACADVL)基因确诊的VLCADD患儿和423507名经MS/MS筛查正常的新生儿资料。采用受试者工作特征(ROC)曲线分别确定所有新生儿组、足月新生儿组和正常出生体重新生儿组C14∶1/C12∶1筛查VLCADD的截断值。同时将不同指标单独或联合组成5个结果判读方案,分别为方案1(C14∶1/C12∶1)、方案2(C14∶1)、方案3(C14∶1+C14∶1/C2+C14∶1/C16)、方案4(C14∶1/C12∶1+C14∶1)和方案5(C14∶1/C12∶1+C14∶1+C14∶1/C2+C14∶1/C16),并计算各方案的检出率、假阳性率、阳性预测值,采用χ^(2)检验比较其筛查效率。结果所有新生儿组、足月新生儿组和正常出生体重新生儿组C14∶1/C12∶1的截断值均为2.80。5个判读方案筛查VLCADD的检出率均为17/17。其中方案1假阳性率[26.15‰(11075/423524)]最高,阳性预测值[0.15%(17/11092)]最低。方案4(方案5)假阳性率最低,为[0.02‰(10/423524)],阳性预测值最高,为[62.96%(17/27)],与方案1、方案2、方案3比较,假阳性率(χ^(2)值分别为302.30、11191.50和32.06)和阳性预测值(χ^(2)值分别为102.51、3485.61和13.83)差异均有统计学意义(P均<0.001)。结论C14∶1/C12∶1是新生儿筛查VLCADD有效的辅助判读指标,推荐C14∶1/C12∶1+C14∶1为非衍生化串联质谱法判读VLCADD的最佳筛查指标组合。

基因组时代产前诊断面临的机遇和挑战

自20世纪70年代开始,染色体核型分析技术作为诊断胎儿染色体异常的金标准已使用多年,但该技术存在分辨率较低(5~10Mb)、培养周期长、检测通量低及有培养失败风险等局限性。随后,靶向诊断技术(FISH、QF-PCR、MLPA)的出现,大大缩短了检测时间,与染色体核型技术联合应用,可早期诊断常见的胎儿染色体异常。此外,Sanger测序作为基因变异检测的金标准,可用于明确致病的单基因疾病的产前诊断。然而,以上技术均无法实现在全基因组范围内进行快速、高分辨率地诊断胎儿致病性变异。

两例精氨酰琥珀酸尿症患儿的临床及基因变异分析

目的 分析两例疑似精氨酰琥珀酸尿症患儿的临床和基因变异特点.方法 应用基于高通量测序技术的基因包进行诊断.结果 例1的串联质谱筛查结果瓜氨酸偏高(87.37~156.10 μmol/L),无特异性临床症状,检测到ASL基因第6外显子c.467C>T变异(p.Pro156Leu)和第7外显子c.556 C>T(p.Arg186Trp)复合杂合变异,其父亲携带c.556C>T杂合变异,母亲携带c.467C>T杂合变异;c.467C>T变异为未报道过的新变异,软件预测其为致病性变异.例2表现为智力低下,有两例因“高氨血症”患儿死亡家族史,检测到ASL基因第3外显子c.281G>T(p.Arg94Leu)和内含子c.208-15T>A复合杂合变异,其父亲携带c.281G>T杂合变异,母亲携带c.208-15T>A杂合变异,均为未报道过的新变异.结论 ASL基因变异为两例患儿的遗传学病因,新变异的检出丰富了ASL基因变异谱.

一例异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症患儿的临床及基因变异分析

目的分析异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症患儿的临床和基因突变特点。方法收集1例新生儿串联质谱筛查发现的可疑异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症患儿的临床资料,采用基于高通量测序技术的基因Panel进行致病基因突变检测。结果串联质谱检测C4升高(波动于0.57~0.68μmol/L之间,参考值:0.08~0.43μmol/L),C4/C3升高(波动于0.44~0.73μmol/L,参考值0.05~0.39μmol/L),C4/C2升高(波动于0.04~0.07μmol/L,参考值0.01~0.04μmol/L),无特殊临床症状。基因检测示ACAD8基因第4外显子c.444G>T(p.Pro148Pro)及第10外显子c.1166G>A(p.Arg389Gln)复合杂合突变,其父携带c.444G>T突变,其母携带c.1166G>A突变。其中c.1166G>A为文献未报道过的新突变。结论ACAD8基因复合杂合突变是本例患儿的遗传学病因,新突变的检出丰富了基因突变谱。

四例极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患儿的串联质谱及基因变异分析

目的探讨4例极长链酰基辅酶A脱氢酶(very long chain acyl-coenzyme A dehydrogenase,VLCAD)缺乏症的临床特征及基因变异特点。方法对新生儿筛查中十四烯酰基肉碱(C14:1)≥0.4μmol/L的新生儿召回复查,通过串联质谱、基因检测确诊4例VLCAD缺乏症患儿,对确诊患儿进行临床和基因变异分析。结果4例患儿血串联质谱结果中C14:1均特异性升高且首次召回复查值均低于初筛值,2例下降到正常范围,1例下降后仍>1μmol/L,1例仅轻微下降。4例患儿中共检出8种变异,以错义变异为主(5/8),并发现3种未报道过的新变异(p.Met344Val,p.Ala416Val,c.1077+6T>A)。均无明显异常临床表现。结论本研究结果扩宽了VLCAD缺乏症的基因谱,为临床VLCAD缺乏症的筛查和诊断提供了经验,为产前诊断提供了依据。

一例早发型精氨酸血症患儿的AGR1基因变异分析

目的对1例早发型精氨酸血症患儿的致病基因进行变异分析,明确其遗传学病因.方法应用基于Ion Torrent半导体测序技术的遗传代谢病基因诊断Panel进行检测,对可疑致病变异进行Sanger测序法验证.结果基因测序结果显示患儿AGR1基因存在c.560+2T>C和c.811T>C复合杂合变异,父亲携带c.560+2T>C杂合变异,母亲携带c.811T>C杂合变异.其中,c.560+2T>C为可疑致病变异,c.811T>C为临床意义不明变异,经检索人群数据库gnomAD、疾病数据库HGMD及文献均为未报道过的新变异.结论AGR1基因c.560+2T>C和c.811T>C复合杂合变异可能为患儿的致病原因,新变异的检出丰富了AGR1基因变异谱.

两例丙酸血症患儿的临床表型及致病基因突变分析

目的研究丙酸血症患儿的临床特征及致病基因突变情况。方法回顾性分析2017年5月至2018年6月南京医科大学附属妇产医院收治的2例丙酸血症患儿的临床资料。提取患儿及父母外周血基因组DNA,应用基于Ion Torrent半导体测序技术的遗传代谢病诊断基因包检测,对可疑致病突变进行Sanger测序验证。对研究数据采用描述性统计分析。结果例1生后次日因"嗜睡、拒乳"疑诊败血症收入院,串联质谱技术新生儿筛查结果提示丙酰肉碱及其比值增高,尿气相色谱质谱检测示3-羟基丙酸、甲基枸橼酸增高,基因检测发现PCCB基因c.331C>T(p.R111X)/c.1228C>T(p.R410W)复合杂合突变,丙酸血症诊断明确,给予特殊饮食辅以左卡尼丁治疗。患儿于3月龄无诱因突发呕吐昏迷夭折。例2于5月龄突发呕吐、嗜睡、精神差就诊,串联质谱检测结果提示丙酰肉碱及其比值增高,基因检测发现PCCB基因c.146delG(p.G49EfsX16)/c.1253C>T(p.A418V)复合杂合突变,其中c.146delG(p.G49EfsX16)为未被报道过的新突变,评估为致病性突变。给予特殊饮食辅以左卡尼丁治疗,患儿依从性差且治疗有间断,随访至3岁8个月,患儿重度发育落后。结论临床疑诊败血症新生儿应考虑丙酸血症可能,并应尽快进行串联质谱和基因检测以明确诊断。新发现基因突变位点的致病性和功能仍有待深入研究。

一例肉碱棕榈酰转移酶1A缺乏症患儿的临床特征和基因变异分析

目的对1例肉碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)缺乏症患儿进行基因变异分析,明确其可能的致病原因。方法应用基于Ion Torrent半导体测序技术的遗传代谢病基因诊断Panel进行检测,基因变异以Sanger测序法验证。结果基因测序结果显示患儿CPT1A基因存在c.1895T>A(p.Leu632X)和c.1153G>A(p.Ala385Thr)复合杂合变异,父亲携带c.1895T>A杂合变异,母亲携带c.1153G>A杂合变异。经查询人类基因突变数据库HGMD、遗传病变异数据库ClinVar及文献资料,均为未报道过的新变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南,c.1895T>A判定为致病性变异(PVS1+PM2+PP4),c.1153G>A判定为可能致病变异(PM1+PM2+PM3+PP3)。结论CPT1A基因c.1895T>A和c.1153G>A复合杂合变异可能是患儿的致病原因,基因检测结果为其临床诊断和遗传咨询提供了依据,新变异的检出拓展了CPT1缺乏症的基因变异谱。