基于TP-PCR的脆性X综合征基因检测与产前诊断

目的:对5例携带FMR1基因前突变的孕妇进行FMR1基因检测并提供遗传咨询和产前诊断。方法:同时应用3种三核苷酸重复引物PCR法(TP-PCR)试剂盒结合毛细管电泳对携带FMR1基因前突变的孕妇及其丈夫外周血DNA、羊水胎儿脱落细胞DNA进行检测,计算FMR1基因5'非编码区CGG重复数,并对携带全突变的女胎进行X染色体失活(XCI)模式检测。结果:5例前突变携带者产前诊断病例中,检出1例正常型男胎,1例全突变型女胎,3例前突变型胎儿。其中,全突变型女胎X失活模式为随机失活,最终选择终止妊娠。使用的3种TP-PCR试剂盒检测FMR1基因分型结果完全一致。结论:通过TP-PCR结合毛细管电泳进行FMR1基因CGG重复数检测,并行X染色体失活模式检测,可为携带FMR1基因前突变的孕妇提供较可靠的遗传咨询和产前诊断。

CNV-seq是否应成为产前诊断常规?

我国出生缺陷发生率约为5.6%[1],很大一部分是由染色体畸变所引起,主要包括染色体数目异常、大片段异常和染色体微缺失微重复。染色体畸变涉及多个基因,可引起多种组织和器官发育异常,绝大部分症状严重,且无有效治疗手段,受累终生,危害严重,产前诊断是现阶段预防染色体畸变的最重要手段。

NR0B1突变致先天性肾上腺发育不全的分子诊断及致病机制

目的 对3例NR0B1基因突变所致的先天性肾上腺发育不全(adrenal hypoplasia congenital, AHC)患者进行分子诊断,以探讨其致病机制并为患者提供遗传咨询。方法 采集3例AHC患者及其家系成员的外周血标本并提取DNA,通过PCR结合Sanger测序对患者的NR0B1基因进行测序分析。结果 在3例AHC患者DNA标本中分别检出NR0B1基因c.676delG、c.509_572dup、c.409G>T半合子突变,并证实均遗传自其母亲。结论 检出的c.676delG和c.509_572dup为未报道的新突变,可判为致病突变,扩展了NR0B1基因突变谱系。

孕妇血浆游离DNA无创产前筛查检测失败及相关妊娠结局

孕妇血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)无创产前筛查(noninvasive prenatal screening,NIPS)是胎儿常见染色体非整倍体最有效的一种产前筛查方法,国内外已广泛开展。值得注意的是,该技术存在无法避免的检测失败,且近几年的一些研究报道发现,这种检测失败可能与胎儿染色体非整倍体和妊娠相关并发症发生存在一定相关性。目前,这方面的报道文献还相对有限,临床意义尚未完全明确。本文将回顾研究报道,探讨无创产前筛查检测失败原因及与胎儿染色体非整倍体、妊娠并发症相关性,探索在检测失败后对孕妇进行临床咨询和妊娠管理指导的理论依据。

用Ion Torrent半导体测序技术对血友病B家系F9基因行突变分析及产前诊断

目的用Ion Torrent半导体测序技术对11个血友病B(HB)家系的F9基因进行序列分析,寻找致病突变,并为遗传咨询和产前诊断提供依据。方法采集11个HB家系先证者及女性成员的外周血样本,抽提基因组DNA,利用Ion Torrent半导体测序技术检测F9基因致病突变,对发现的致病突变进行Sanger测序验证。进一步对7例高危家系孕妇进行羊膜腔穿刺,采集胎儿羊水样本,并进行产前诊断。结果13例HB患者均存在F9基因致病性突变,共发现10种突变,其中1种为新的突变类型。对8例胎儿进行产前诊断,其中1例为半合子突变,2例为杂合突变,5例不携带母源致病突变。结论用Ion Torrent半导体测序技术检测F9基因的突变谱,对于HB家系携带者的产前诊断具有一定的临床意义。

1例智力障碍合并癫痫家系基因变异分析及产前诊断

目的:对1例智力障碍合并癫痫的患儿及其家系进行分子遗传学检测,明确其致病原因,为产前诊断提供依据。方法:应用全外显子测序技术寻找患儿的致病变异,使用Sanger测序技术对患儿及其家系进行致病位点验证,并通过羊水穿刺和Sanger测序为患儿母亲提供产前诊断和遗传咨询。结果:全外显子测序和Sanger验证结果表明,患儿DYRK1A基因存在c.504dupT(p.D169*fs*1)杂合突变,其父母该位点均为野生型,为新发突变。对患儿母亲羊水样本进行检测,胎儿DYRK1A基因c.504位点未检测到变异。结论:全外显子测序技术检测到DYRK1A基因c.504dupT导致的常染色体显性遗传性智力障碍7型可能是该患儿的致病原因,有助于对该家系进行遗传咨询和产前诊断,同时丰富了该致病基因的变异谱。

面肩肱肌营养不良症患者外周血单个核细胞来源的诱导多能干细胞的构建及骨骼肌分化

目的建立并鉴定面肩肱肌营养不良症(FSHD)患者外周血单个核细胞(PBMC)来源的诱导多能干细胞(iPSCs),初步探讨其骨骼肌分化能力,评估该细胞模型应用于疾病机制研究的可行性。方法收集1例FSHD患者的PBMC,用含4个重编程转录因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)的仙台病毒感染PBMC并获得FSHD患者来源的iPSCs,继续诱导其骨骼肌分化。通过基因组光学图谱技术、核型、免疫荧光染色、实时荧光定量PCR等分析iPSCs和骨骼肌细胞特性。结果成功获得FSHD患者来源的iPSCs,其可表达多能干性标记。FSHD-iPSC核型及D4Z4拷贝数结果与患者的临床背景一致,并在体外可定向诱导分化为骨骼肌细胞,该细胞同时表达DUX4致病基因以及调节基因。结论FSHD患者来源的PBMC可重编程为iPSCs,FSHD-iPSC可分化为疾病相关的肌源组细胞及肌管细胞,为FSHD发病机制的体外研究提供了良好的细胞模型,并为寻找该病的有效治疗手段提供了工具。

HPV与宿主基因整合在宫颈病变发生发展中的作用机制研究进展

宫颈癌病死率较高,高危人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是其主要致病原因,其中HPV与宿主基因整合在宫颈病变的发生发展中发挥关键作用。目前,以三代测序技术为代表的新兴技术已用于HPV整合位点及基因改变等的相关检测。HPV整合后可能通过基因扩增、染色体结构改变、改变DNA序列甲基化状态、形成染色体外DNA、导致宿主致癌基因激活和抑癌基因失活以及影响微RNA的表达等发挥促癌作用。因此,深入研究HPV与宿主基因整合在宫颈病变发生发展中的作用机制,可以为相关疾病的治疗提供新思路。

一种新型线粒体DNA深度测序方法的准确性评估

目的 与基于长片段PCR(lrPCR)的传统mtDNA测序方法比较,评估本课题组前期研究开发的一种新型非PCR依赖的mtDNA深度测序方法的可靠性。方法 同时采用新方法和传统方法对10例产前筛查孕妇外周血样本进行平行试验,对比两种方法所得结果,结合人群数据库(MitoMAP和mtDB)信息,评估新方法的准确性。结果 10例样本中共检出380个变异,其中351个变异同时被两种方法检出,29个变异仅被单一方法检出。对29个不一致变异中出现于2个或2个以上样本的8个变异进一步分析发现,2个仅被新方法重复检出的变异在人群数据库中存在记录;而6个仅传统方法重复检出的变异在人群数据库中未见记录。结论 与传统基于lrPCR的mtDNA测序方法相比,新方法针对同质性变异及高异质度变异的检测能力相当,而针对低异质度变异检测时具有更高的准确性。

一种基于线粒体分离纯化技术的新型线粒体DNA深度测序方法

目的 开发并评估一种基于线粒体分离纯化技术的线粒体DNA(mtDNA)深度测序方法。方法 探索从细胞中分离mtDNA的最适条件;基于该方法对外周血单个核细胞(PBMC)样本进行mtDNA深度测序,通过测序片段(reads)中mtDNA reads占比评估测序文库中mtDNA的纯度,通过Sanger测序验证该方法所检出的mtDNA变异的准确性。结果 采用含低浓度NP40和不含Tween-20的裂解液裂解细胞获得的mtDNA纯度高,几乎不含细胞核基因组。在6例PBMC样本中应用该方法检测结果显示,mtDNA reads占比为87.8%~92.8%,且检测出多个mtDNA变异。对其中1个异质性变异和3个同质性变异进行Sanger测序验证,二者结果相一致。结论 本研究开发的基于线粒体分离纯化技术的mtDNA深度测序方法可应用于PBMC样本,能准确且灵敏地检出线粒体基因组的同质性和异质性变异。

胎儿侧脑室增宽与拷贝数变异的研究进展

侧脑室增宽(ventriculomegaly,VM)是一种常见的超声异常,与感染、染色体异常及结构畸形相关。目前,传统的核型分析技术是检测胎儿侧脑室增宽遗传学病因的主要手段。近年来,由于染色体微阵列分析技术(chromosomal microarray analysis,CMA)在产前诊断领域的广泛应用,VM被发现与拷贝数变异(copy number variations,CNVs)密切相关。最近研究表明,除了染色体数目异常和大片段结构异常外,致病性CNVs是胎儿VM的另一个重要遗传学原因,并且可能参与胎儿VM的病理过程以及出生后神经发育障碍。此外,VM胎儿致病性CNVs的检出率与是否合并其他结构异常有关,但与VM的严重程度无关。然而,由于CNVs是胎儿VM的重要原因,因此,应建议所有VM胎儿进行CMA检测,无论VM的严重程度或是否合并其他结构异常。

1例Dandy-Walker综合征合并Xq28重复综合征胎儿的遗传学分析

目的对1例超声检查提示为Dandy-Walker综合征和先天性心脏病的胎儿进行遗传学分析。方法取引产胎儿的皮肤样本,进行单核苷酸多态性微阵列分析(single nucleotide polymorphism array,SNP array),并采用多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)进行验证。胎儿父母外周血样本进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)分析。结果SNP array分析结果显示胎儿染色体6p25.3p25.1存在5.4 Mb缺失,Xq28存在4.2 Mb重复,均为致病性拷贝数变异。MLPA验证结果与SNP array结果一致。胎儿父母外周血的FISH分析结果显示未发现相关片段的缺失、重复或易位等异常。结论胎儿6p25.3p25.1缺失和Xq28重复均为新发变异,可能与超声提示Dandy-Walker综合征和先天性心脏病有关。

孕妇外周血游离DNA检测用于胎儿16-三体筛查的临床价值

目的 探讨孕妇血浆游离DNA(cf-DNA)检测技术用于胎儿16-三体综合征(16-三体)筛查的临床应用价值。方法 收集2017年1月至2021年12月在南京市妇幼保健院进行孕妇血浆cf-DNA检测且结果为16-三体高风险的孕妇,对其侵入性产前诊断验证结果,并对妊娠结局进行回顾性分析。结果 在56 247例进行cf-DNA检测的孕妇中,检出16-三体高风险22例(0.04%,22/56 247);其中8例选择了侵入性产前诊断,检出2例单亲二倍体,未检出胎儿真阳性,阳性预期值为0;妊娠结局回访发现22例16-三体高风险孕妇中,19例(87.4%,19/22)孕妇存在流产、胎儿发育异常、早产、生长发育迟缓等。结论 血浆cf-DNA检测提示16-三体高风险中胎儿真阳性的可能性小,多数可能是限制性胎盘嵌合;cfDNA检出16-三体高风险中大部分孕妇存在不良妊娠结局,应密切关注这类胎儿的生长发育情况及围产期可能的并发症。

PRRT2 c.649C>T突变导致智力障碍以及蛋白质表达异常

目的利用全外显子测序技术寻找1例智力障碍合并癫痫及运动障碍患者的遗传学病因,并探究其致病机制。方法提取患儿及父母双方的外周血DNA,使用外显子测序技术寻找患儿的致病基因,并使用Sanger测序验证致病位点。利用小鼠cDNA诱导克隆该致病基因并构建质粒,采用western blot检测致病基因蛋白与野生型蛋白的表达情况。结果全外显子测序检测发现该患者PRRT2基因存在无义突变(c.649C>T;p.R217X),遗传自母亲;Sanger测序验证结果与外显子捕获测序结果相一致。western blot证实小鼠PRRT2 R223X突变蛋白(对应人PRRT2 R217X)不能正常表达。结论PRRT2基因c.649C>T突变可能是该例患者智力障碍的致病原因。突变的PRRT2 R217X蛋白不能正常表达。

利用人多能干细胞来源的神经管模型探究丙戊酸钠的致畸机制

目的 利用人多能干细胞来源的体外神经管模型探索丙戊酸钠(VPA)导致神经管畸形的疾病发生机制。方法 悬浮培养人多能干细胞并进行体外神经诱导,通过免疫荧光染色法检测多能性标志物八聚体结合转录因子4(Oct-4),神经特性标志物成对框基因6(PAX6),E-钙黏蛋白(ECAD)、N-钙黏蛋白(NCAD),细胞骨架标志物F-肌动蛋白(F-actin)和极性标志物蛋白激酶λ(PKCλ)等指标的表达水平以验证体外神经管模型;采用VPA的药物作用试验对各实验组(VPA 0.1、1和10μmol/L组)及对照组进行进一步的验证。结果 免疫荧光染色法检测结果表明,多能性标志物OCT4的表达水平减少;神经特性标志物PAX6的表达水平增加;ECAD与NCAD的表达模式存在时空转变;F-actin和PKCλ均集中表达于细胞顶部;对照组、VPA 0.1、1和10μmol/L组的细胞直径分别为(90.81±0.88)μm、(87.14±1.35)μm、(77.19±1.34)μm和(75.63±0.86)μm, VPA 10μmol/L及1μmol/L组与对照组之间差异均具有统计学意义(P均<0.05);VPA 1μmol/L组中F-actin和PKCλ的表达均未聚集在细胞顶面。结论 成功建立人多能干细胞来源的体外神经管模型;VPA对体外神经管具有呈剂量依赖性的生长抑制作用;VPA通过影响细胞骨架功能和细胞极化导致lumen形成失败,是其导致神经管畸形的潜在疾病发生机制。

Dravet综合征SCN1A基因新突变及遗传咨询

目的 对2例癫痫伴精神运动发育迟缓的患儿进行遗传学病因分析,旨在为患儿治疗及其家庭遗传咨询、生育指导提供依据。方法 提取2例患儿及其父母外周血基因组DNA并采用全外显子测序技术进行检测,按照美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG,2015)标准进行致病性分析,通过Sanger测序验证致病变异。结果 全外显子测序结果发现,2例患儿电压门控性钠离子通道α1亚单位基因(SCN1A)基因存在c.5354T>C(p.I1785T)和c.4380T>A(p.Y1460*)新发de novo杂合突变,分别评估变异为可疑致病、致病突变位点,Sanger测序验证了该突变并确认双方父母相应位点均为野生型。结论 结合临床和基因诊断信息,2例患儿均被诊断为常染色体显性遗传病Dravet综合征,明确患儿的致病原因对于合理治疗方案的制定及其家庭的优生优育、遗传咨询具有重要的意义。

扩展性携带者筛查病种纳入的研究进展

扩展性携带者筛查是出生缺陷一级预防的主要措施之一,在过去数年取得了长足发展,实现了单基因遗传病由被动诊治模式向主动预防模式的突破性转变,其可行性及临床应用价值得到了广泛认可。随着技术的进步,可筛查的单基因遗传病达千余种。但是,哪些单基因遗传病适合临床大规模筛查一直是产前诊断领域内争论的焦点。本文针对扩展性携带者筛查病种纳入的数量、疾病属性、受试者的意见、社会伦理学影响等方面的国内外研究进展进行综述,为扩展性携带者筛查在临床规范有序的开展提供依据。