miR-21真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨人微小RNA-21(miR-21)重组表达质粒对人胃癌SGC-7901细胞增殖与凋亡的影响及可能机制。方法设计合成靶向miR-21的互补双链DNA,退火后与真核表达载体pPG-miR-EGFP克隆连接,构建pPG-miR-21-EGFP重组表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM 2000将鉴定正确的重组表达质粒pPG-miR-21-EGFP转染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察转染效率。实验分为3组:空白对照组、空载体组、重组表达质粒组。以RT-PCR检测转染前后胃癌细胞miR-21的表达水平。MTT法评价重组表达质粒抑制肿瘤细胞生长的效果,流式细胞术及Hoechst 33258法检测转染后胃癌SGC-7901细胞周期的分布和凋亡。Western blot法、免疫细胞化学法分别检测转染前后PTEN、PCNA、PDCD4、bcl-2、cyclin D1蛋白表达的水平。结果酶切及测序鉴定证实成功构建重组质粒pPG-miR-21-EGFP,转染人胃癌SGC-7901细胞后,荧光显微镜下观察转染效率达75%。RT-PCR检测显示重组表达质粒组胃癌细胞miR-21的表达下调,与空白对照组和空载体组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot法、免疫细胞化学法检测结果显示重组表达质粒组胃癌细胞cyclinD1、PCNA、bcl-2蛋白的表达下调(P<0.05),而PDCD4、PTEN蛋白的表达上调(P<0.05)。重组表达质粒组的细胞生长缓慢,凋亡指数增加。流式细胞术检测结果显示重组表达质粒组G1期细胞的百分比较空白对照组增加[(69.71±0.314)%vs(50.1±0.331)%],S期细胞较空白对照组明显减少[(14.68±0.448)%vs(28.47±0.316)%](P<0.05)。结论重组表达质粒pPG-miR-21-EGFP可显著下调miR-21在胃癌SGC-7901细胞中的表达,并在一定程度上抑制胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,使较多的细胞停留在G1期,S期细胞减少,其作用机制可能是通过下调cyclinD1、PCNA、bcl-2蛋白的表达,上调PDCD4、PTEN蛋白的表达而实现的。