隐丹参酮通过调节TGF⁃β/Smad通路改善高氧诱导肺损伤的纤维化过程

目的:探讨隐丹参酮(cryptotanshinone,CTS)对高氧诱导的支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)大鼠肺纤维化的影响及作用机制。方法:体内实验:将50只新生雄性SD大鼠随机分为空气组、高氧组、CTS低剂量组(7.5 mg/kg)、CTS中剂量组(15.0 mg/kg)及CTS高剂量组(30.0 mg/kg)。高氧组及CTS干预组大鼠饲养于氧浓度95%的氧箱中,空气组饲养于空气中。CTS干预组大鼠生后每日给予CTS腹腔注射,空气组及高氧组每日腹腔注射同等体积DMSO。7 d后安乐死全部大鼠后取肺组织用于后续实验。应用HE染色观察肺泡病理改变;通过Masson染色观察肺组织纤维化程度;RT⁃qPCR法检测转化生长因子β1(transforming growth factor⁃β1,TGF⁃β1)及α平滑肌肌动蛋白(α⁃smooth muscle actin,α⁃SMA)的mRNA水平;Western blot检测细胞信号转导分子(small mother against decapentaplegic,Smad)2/3、p⁃Smad2/3的表达。体外实验:选用人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblast⁃1,HFL⁃1),按照培养条件分为空气组、高氧组及CTS干预组,空气组常规条件下培养,而高氧及干预组置于95%O2恒温培养箱中培养24 h,干预组加入CTS 10μmol/L。CCK⁃8实验检测细胞活力;Western blot检测TGF⁃β1、α⁃SMA、p⁃Smad2/3、Smad2/3蛋白表达变化。结果:与对照组相比,高氧组大鼠肺泡形态紊乱、间隔增宽,RAC值下降,纤维化评分上升(P<0.05);TGF⁃β1及α⁃SMA的mRNA水平升高(P<0.05);p⁃Smad2/3表达升高(P<0.05);不同剂量的CTS给药后可改善上述指标(P<0.05);同时,CTS还可以降低高氧后HFL⁃1细胞的TGF⁃β1、α⁃SMA、p⁃Smad2/3、Smad2/3表达(P<0.05)。结论:CTS可通过TGF⁃β/Smad通路改善高氧诱导肺损伤的纤维化过程。

长链非编码RNA NANCI-NKX2.1信号通路在BPD新生小鼠肺组织中作用的研究

目的:探讨长链非编码RNA(lnc RNA)NANCI-NKX2.1信号通路在新生小鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)形成过程中的作用。方法:将32只C57BL/6J新生小鼠随机分为实验组、阴性对照组、生理盐水对照组和空白对照组,每组8只。实验组于生后第2天经鼻腔吸入含lnc RNA NANCI干扰序列的腺病毒Ad-lnc NANCI sh RNA的生理盐水1μL,阴性对照组将含无关序列发卡结构病毒质粒Ad-GFP NC的生理盐水1μL导入肺内,生理盐水对照组将生理盐水1μL导入肺内,空白对照组除未予鼻腔吸入以外其他控制因素与上3组相同;于出生后7 d处死各组小鼠并采集肺组织。采用HE染色法察看小鼠肺组织病理变化,采用RT-q PCR检测NANCI表达量,RT-q PCR及Western blot技术分别检测NKX2.1、SPC、AQP5 m RNA和蛋白表达水平。结果:实验组肺组织病理示新隔形成减少,肺泡腔扩大、部分融合,肺泡数目较少,RAC值下降(P<0.05);肺组织NANCI表达量下降(P<0.05);NKX2.1、SPC及AQP5 m RNA和蛋白的表达量亦下降(P<0.05)。结论:NANCI-NKX2.1信号通路在BPD新生小鼠中可能起重要作用。

CXCL4与高氧诱导新生小鼠性别差异性肺损伤的相关研究

目的:探讨肺组织CXC趋化因子配体4(chemokine C-X-C motif ligand 4,CXCL4)与高氧诱导新生小鼠性别差异性肺损伤的关系及相关机制。方法:32只C57BL/6J新生小鼠(雄性、雌性各16只)随机分为4组:高氧雄性组、高氧雌性组、空气雄性组、空气雌性组(每组8只)。高氧组小鼠置于95%氧浓度下暴露7 d,空气组于室内环境(FiO2=21%)中饲养。串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)定量蛋白组学技术检测4组小鼠肺组织中蛋白质的表达变化,筛选差异表达的蛋白质;ELISA法检测肺组织匀浆CXCL4含量;HE染色法观察小鼠肺组织病理改变;冰冻切片免疫荧光染色检测肺组织'M4'型巨噬细胞(MMP7+ S100A8+)分布情况。结果:高氧暴露组肺组织肺泡化程度降低,辐射状肺泡计数(radial alveolar count,RAC)明显减小(P <0.001);与高氧雌性组相比,高氧雄性组RAC值下降(P <0.01)。TMT筛选出的CXCL4在高氧雄性组差异性表达上调;肺组织匀浆验证了质谱分析结果。高氧雄性小鼠肺组织MMP7+ S100A8+细胞增多。结论:高氧诱导新生小鼠肺损伤程度存在性别差异,雄性损伤程度高于雌性,可能与CXCL4诱导肺'M4'型巨噬细胞形成存在一定的相关性。

LRP1-pPyk2-MMP9通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用

目的探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白1(low-density lipoproteinreceptor-related protein 1,LRP1)-磷酸化酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosinekinase 2 phosphorylation,pPyk2)-基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中的作用。方法将16只新生大鼠随机分为空气组和高氧组,每组8只。高氧组大鼠于生后即置于吸入氧浓度>95%的环境中7 d,空气组大鼠置于同室空气环境中;第8天处死全部大鼠。苏木精-伊红染色法观察两组大鼠肺组织病理变化;ELISA法检测血清及支气管肺泡灌洗液中可溶性LRP1(sLRP1)、MMP9水平;Western blot法检测肺组织LRP1、MMP9、pPyk2及Pyk2蛋白表达水平;RT-PCR法检测肺组织LRP1 mRNA及MMP9 mRNA表达水平。结果血清和支气管肺泡灌洗液中sLRP1、MMP9在高氧组的水平均高于空气组(P<0.05);高氧组肺组织匀浆LRP1、MMP9、pPyk2蛋白表达水平较空气组显著升高(P<0.05);肺组织LRP1 mRNA、MMP9 mRNA在高氧组的相对表达量显著高于空气组(P<0.05)。结论LRP1-pPyk2-MMP9通路在高氧诱导新生大鼠肺损伤中活化增强,可能参与支气管肺发育不良的发病机制。

高氧肺损伤新生小鼠肺组织中GM15886和HIPK1的表达研究

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)GM15886在高氧诱导新生小鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)肺组织中表达水平的变化,及其可能的作用机制。方法:选取BPD模型小鼠肺组织lncRNA基因芯片中高表达的GM15886进行验证,应用IntaRNA、Multi Experiment Matrix和Ensemble数据库预测其靶基因;将64只新出生C57BL/6J小鼠随机分为高氧组和空气组,每组各32只;高氧组新生小鼠置于95%高氧环境下,空气组暴露于空气环境下,分别于生后第0、3、5、7天处死小鼠取肺组织,HE染色评价肺组织病理变化;采用qPCR检测GM15886和同源结构域相互作用蛋白激酶1(homeodomain-interacting protein kinase 1,HIPK1)表达水平;免疫组化检测HIPK1表达情况。结果:IntaRNA预测GM15886碱基序列能够和HIPK1第2个外显子碱基序列完全结合。qPCR示高氧组第3、5、7天GM15886表达量升高,分别为1.91±0.28、2.12±0.38、2.35±0.43,与第0天相比,差异均具有统计学意义(P均<0.05);HIPK1在第3、5、7天相对表达量分别为1.16±0.33、0.92±0.31、3.12±0.46,第7天表达量高于第0、3、5天(P均<0.05);HIPK1免疫组化表现与RNA表达的结果相对应。结论:随着高氧暴露时间的延长,肺组织GM15886表达量增加;GM15886可能靶向HIPK1参与BPD的发病机制。

肌腱蛋白C对支气管肺发育不良诊断价值的前瞻性研究

目的:探讨血清肌腱蛋白C(tenascin C,TNC)对早产儿支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的诊断价值。方法:选择2018—2020年南京医科大学附属淮安第一医院新生儿科79例极低出生体重早产儿,根据美国国家儿童健康和人类发育研究所诊断标准分为非BPD组(n=48)和BPD组(n=31)。ELISA法检测血清TNC水平;多因素Logistic回归分析BPD发生的独立危险因素;Kendall相关分析血清TNC水平与BPD严重程度的相关性;绘制TNC诊断BPD的受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线。结果:①早产儿血清TNC水平在非BPD组与BPD组间差异有统计学意义[(95.03±19.73)ng/mL vs.(125.40±19.34)ng/mL,P<0.001],不同级别BPD组间差异有统计学意义(P<0.001);②早产儿发生BPD的独立危险因素包括出生体重、高浓度氧吸入时间及血清TNC水平(P<0.05);③血清TNC水平与BPD严重程度呈正相关(r=0.617,P<0.001);④血清TNC诊断BPD的ROC曲线下面积为0.881(P<0.001),灵敏度为96.8%,特异度为66.7%。结论:血清TNC水平在BPD中增高,诊断的灵敏度及特异度较高,可作为判断早产儿BPD的标志物之一。

支气管肺发育不良模型小鼠青春期肺部菌群特点

目的:探究支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)模型小鼠青春期肺部菌群特点。方法:32只C57BL/6J新生小鼠,分为空气雌性组、空气雄性组、高氧雌性组、高氧雄性组,每组8只。高氧组小鼠生后即置于FiO2>95%的环境中7 d,空气组小鼠置于同室内空气(FiO2=21%)环境;之后所有小鼠室内空气环境下饲养直至6周。苏木精⁃伊红(hema⁃toxylin⁃eosin,HE)染色法观察小鼠肺组织病理变化;16S rDNA测序分析肺组织菌群特点。结果:BPD模型小鼠青春期肺组织肺泡化程度降低(P<0.01),双因素方差分析显示性别对小鼠辐射状肺泡计数(radial alveolar count,RAC)变化无显著差异(F=2.001,P>0.05)。Anosim相似性分析结果显示空气组和高氧组雄性小鼠肺部菌群差异有统计学意义(r=0.906,P=0.03),雌性小鼠菌群差异无统计学意义(r=-0.094,P=0.722)。Alpha多样性结果显示高氧组和空气组的肺部菌群物种丰富度无统计学差异(P>0.05),Beta多样性分析中,PCoA图显示4组肺部菌群存在统计学差异(P<0.05)。LEfSe分析结果显示,高氧组棒状杆菌属(Corynebacterium)丰度下降,葡萄球菌种(Staphylococcus)升高。结论:BPD模型小鼠青春期肺部微生物群失调,棒状杆菌属(Corynebacterium)丰度下降,葡萄球菌种(Staphylococcus)升高,并且菌群失调可能与性别相关。

肺部微生物组与儿童支气管哮喘内型关系的研究进展

目前认为支气管哮喘(简称“哮喘”)不是一种单一的疾病,而是一组具有多种表型且机制涉及多条信号通路的综合征。儿童哮喘通常起源于学龄前期,其病因复杂多样。近年来,随着高通量测序技术的发展,发现早期肺部菌群的改变与哮喘的发生发展有关,并且肺部菌群在不同气道炎症(哮喘内型)之间存在显著差异。因此,了解哮喘儿童肺部菌群特点,有助于控制儿童哮喘的进展及改善预后,为哮喘患儿的诊治提供新的思路。

高胆红素血症患儿早期头颅影像学异常的门诊随访研究

目的通过对早期头颅MRI和（或）氢质子磁共振频谱（1H—MRS）诊断异常的高胆红素血症患儿进行门诊随访，评估头颅MRI和1H—MRS在高胆红素血症临床诊断中的价值。方法100例高胆红素血症患儿行头颅MRI和或1H—MRS检查，结果异常。给予必要的临床干预后出院，并按时门诊随访。随访内容包括临床神经检查、头颅MRI和或1H—MRS等。月龄小于6个月者，每月随访1次，月龄大于或等于6个月以上者，每2个月随访1次，随访到1岁。结果7日龄时单项MRI、单项1H—MRS、MRI和1H—MRS均异常的胆红素脑损伤诊断率分别是57．0％、75．0％和25．0％，显著高于临床胆红素脑损伤诊断率12．0％（P〈0．05）。3月龄时单项MRI、单项1H—MRS的胆红素脑损伤诊断率均为39．2％，显著高于临床胆红素脑损伤诊断率21．6％（P〈0．05）。1岁时，各指标对胆红素脑损伤的诊断率相比，差异无统计学意义（P〉0．05）。结论早期头颅MRI或1H—MRS对胆红素脑损伤的诊断较敏感，动态随访患儿MRI检查比单次检查更有临床意义。

长链非编码RNA 1010001 N08 Rik在支气管肺发育不良形成中的表达规律及生物信息学分析

目的 初步研究长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA） 1010001N08Rik在高氧诱导新生小鼠支气管肺发育不良（bronchopulmonarydysplasia,BPD）形成过程中的表达规律,并对其进行系统的生物信息学分析,预测其参与BPD发生发展的可能作用机制.方法 通过UCSC在线基因浏览工具获取1010001N08 Rik序列、所在基因组位置及其邻近基因相关信息;应用Ensemble数据库预测1010001N08Rik的靶基因.将新生C57BL/6J小鼠置于95％高氧环境下7d,制备高氧诱导新生小鼠BPD模型.采用逆转录聚合酶链反应检测1010001N08Rik、Gata 6 mRNA在BPD形成过程（第0、1、3、5、7天）中的变化情况,并通过t检验比较其表达差异.结果 1010001N08Rik在BPD形成过程第1、3、5、7天相对表达量分别为1.21±0.33、2.02±0.41、2.95±0.45、4.20±0.48,其表达逐渐增加,且第1、3、5、7天各组相近两个时点间差异均有统计学意义（P＜ 0.05）;Gata 6 mRNA第1、3、5、7天相对表达量分别为0.92±0.30、1.10±0.31、0.86±0.24、0.45±0.08,第7天低于第5天（P＜0.05）,其余相近两个时间点比较差异无统计学意义（P＞0.05）.1010001N08Rik在哺乳动物间具有较高的保守性,其所在染色体区域存在大量转录因子结合位点及表观遗传学线索,Gata 6为其可能的调控靶标.结论 1010001N08Rik在BPD形成过程中表达量逐渐增加,生物信息学分析及初步实验提示其可能通过下调Gata 6表达参与BPD形成过程.

血清肌腱蛋白C水平与早产儿支气管肺发育不良伴肺动脉高压的相关性研究

目的初步探讨血清肌腱蛋白C(tenascin C,TNC)水平在早产儿支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)伴肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)预测中的临床应用价值。方法采用前瞻性研究,选取2017年1月至2020年6月南京医科大学附属淮安第一医院新生儿重症监护病房收治的胎龄<32周、诊断重度BPD的早产儿为研究对象,行超声心动图检查评估BPD合并PH情况,根据是否存在PH分为BPD伴PH组和BPD无PH组,诊断同时采集静脉血行血清TNC检测,分析重度BPD患儿血清TNC水平与PH发生的相关性。结果共纳入重度BPD患儿59例,其中伴PH 21例(35.6%)。BPD伴PH组血清TNC水平高于BPD无PH组[(123.7±41.1)ng/ml比(78.2±20.2)ng/ml,P<0.05)],血清TNC水平与肺动脉收缩压成正相关(r=0.861,P<0.001)。血清TNC预测BPD合并PH的受试者工作特征曲线下面积为0.884.以TNC≥87.7 ng/ml为标准预测BPD合并PH的敏感度为84.0%,特异度为76.9%。结论重度BPD患儿PH发生率较高,重度BPD伴PH患儿血清TNC水平升高,与肺动脉收缩压成正相关,血清TNC对BPD合并PH的预测有一定临床价值。