气液界面培养体外构建角膜上皮的实验研究

目的:建立气液界面培养体外构建兔角膜上皮的方法。评价体外构建角膜上皮的生物学特性。方法:新西兰白兔15只30只眼,取角膜缘上皮组织。组织块接种原代培养。细胞融合生长后,消化传代。以去上皮细胞人羊膜组织为载体,接种培养传代细胞,细胞融合后,用气液界面培养方法继续培养周。倒置显2微镜对体外构建的角膜上皮进行观察。培养细胞膜片固定,苏木精-伊红(H)E染色;AE1细胞角蛋白单克隆抗体免疫组化染色,光镜观察。常规制作电镜标本,透射电镜观察。以传统培养方法作为对照。结果:倒置显微镜观察,气液界面培养可以形成连续的上皮细胞层,细胞和载体之间连接较牢固。HE染色显示体外构建的角膜上皮具有复层扁平上皮的结构。免疫组化染色有较高的阳性率。透射电镜观察细胞之间有丰富的桥粒样连接。结论:气液界面培养方法可以构建复层鳞状角膜上皮。与传统培养方法比较,构建的角膜上皮组织具有较优越的生物学特性。

自体组织工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症

目的:用组织工程方法构建角膜上皮组织,观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性。方法:①实验于2000-01/2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成。选用新西兰白兔15只,雌雄不拘。用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型,为移植实验的受体眼。另一只眼为供体眼。15只兔被随机分为3组:自体角膜上皮移植,羊膜移植组,对照组。②自体角膜上皮移植组:取供体眼角膜缘上皮组织约3mm3,体外培养。对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察,采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色;采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达;对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察。在去除上皮的保存人羊膜组织上,接种培养细胞,气液界面培养2周构建复层上皮组织。倒置显微镜观察细胞形态和生长特征;组织固定,包埋,切片,染色,观察细胞生长状态和蛋白表达。透射电镜观察超微结构。5只眼成模后4周,受体眼去除角膜浅层新生血管膜,行自体培养角膜上皮移植术。羊膜移植组:5只眼成模后4周,行羊膜移植修复角膜表面;对照组:5只眼成模后不做处理,为模型对照组。③移植实验后7,10,20,30d,分别行裂隙灯显微镜检查,角膜荧光素染色,眼前部照相。并分别处死各组动物,取手术区域角膜组织,甲醛固定,石蜡包埋,病理切片,染色,镜检观察。结果:①培养细胞的生长状态:原代培养48h细胞贴壁,15d左右形成单层。传代培养次日细胞贴壁,10d形成良好的单层。细胞胞体饱满,呈多角形,大小基本一致。②培养细胞的形态学特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,核呈长圆形,细胞大小一致,排列整齐。AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性。③培养细胞的超微结构:透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接,缝隙连接。扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构。④羊膜上接种细胞的生长特征:24h细胞贴壁生长,1周左右融合成单层。气液界面培养,细胞透明饱满,均匀成片生长,持续培养2周,细胞呈复层生长。⑤组织工程化角膜上皮形态特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,在羊膜上融合成片。组织切片,细胞在羊膜上可达到四五层。透射电镜可见桥粒样结构。⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验:自体角膜上皮移植组:移植区角膜上皮细胞覆盖,呈复层排列,基底细胞呈柱状,基底膜完整。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。供体角膜未出现临床病理性损伤。羊膜移植组:移植区域表层有上皮细胞覆盖,层次紊乱,极性消失。基质内有炎性细胞和红细胞浸润。对照组:角膜上皮排列紊乱,基底膜不完整,基质内有中性白细胞和红细胞浸润。结论:①角膜干细胞在体外能够培养传代。②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长,经气液界面培养,构建出复层上皮组织,与正常角膜上皮组织近似。③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症。