p53^(mut)、p53^(wt)、p16基因转染对肺腺癌H1299细胞Samd4蛋白表达的影响

目的探讨外源性p53mut、p53wt和p16基因转染人肺癌细胞株H1299后对其Smad4蛋白表达的影响。方法运用PCR方法扩增p53mut、p53wt及p16基因,构建真核表达载体p IRES2-EGFP-p53mut、p IRES2-EGFP-p53wt及p IRES2-EGFP-p16,脂质体法单独或共转染H1299细胞。荧光显微镜下观察细胞中表达的带绿色荧光的增强型荧光蛋白(EGFP),使用RT-PCR验证质粒载体转染效果,使用Western blot检测转染后各组细胞Smad4蛋白表达水平的变化。结果转染72小时后在荧光显微镜下观察到被转染的H1299细胞发绿色荧光。经RT-PCR证实转染后的H1299细胞成功表达目的基因。Western blot法显示空载体组与空白对照组在Smad4蛋白表达上无明显差异(P>0.05),p53mut组Smad4蛋白表达较空载体组下调(P<0.05),而p53wt转染组或p53wt、p16联合转染组Smad4表达增强,且以后者的上调作用更为明显(P<0.05)。结论 p53mut转染可抑制H1299细胞的Samd4蛋白表达,而单独转染p16或共转染p16、p53wt可使Smad4蛋白表达上调,且以后者的上调作用更为显著。p53mut的促癌作用及p53wt和p16的抑癌作用可能与TGF-β/Smad4相关信号通路有关。

p53和p16基因过表达对人肺腺癌细胞株H1299生物学功能影响实验研究

目的 p53及p16基因是肺腺癌的两种重要的驱动基因,但其在肺腺癌发生发展中的作用尚不明确。本研究探讨外源性突变型p53(p53mut)、野生型p53(p53wt)和p16基因过表达对人肺腺癌细胞株H1299生物学功能的影响。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP-p53mut、pIRES2-EGFP-p53wt和pIRES2-EGFP-p16,将H1299细胞分为空白对照组、阴性对照组和转染组(p53mut转染组、p53wt转染组、p53wt和p16联合转染组),空白对照组只加转染试剂,阴性对照组转染空载体,转染组转染含目的基因的过表达载体。蛋白质印迹法验证质粒载体转染效果,细胞增殖检测试剂盒8(cell counting kit8,CCK8)、划痕试验、Transwell小室侵袭实验分别检测转染前后细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化,流式细胞术检测转染前后细胞周期和凋亡的变化。结果真核表达载体质粒经测序鉴定证明构建正确。蛋白质印迹法证实,空白对照组及阴性对照组的H1299细胞不表达p53和p16蛋白。转染组的H1299细胞成功过表达目的基因(p53mut、p53wt及p16)。CCK8实验提示,空白对照组与阴性对照组在细胞增殖能力上差异无统计学意义(P>0.05),p53mut转染组细胞增殖能力增强,p53wt转染组及p53wt、p16共转染组细胞的增殖能力减弱,且以后者下降更为明显,P<0.001。划痕试验提示,空白对照组与阴性对照组细胞在迁移能力差异无统计学意义(P>0.05),p53mut转染组细胞迁移能力增强,p53wt转染组及p53wt、p16共转染组细胞迁移能力减弱,且以后者下降更为显著,P<0.001。Transwell小室侵袭实验提示,空白对照组与阴性对照组细胞的侵袭能力差异无统计学意义(P>0.05),p53mut转染组细胞侵袭能力增强,p53wt转染组及p53wt、p16共转染组细胞侵袭能力减弱,且以后者减弱更为明显,P<0.001。流式细胞术检测提示,空白对照组与阴性对照组G1期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05),而p53wt转染组及p53wt、p16共转染组出现了G1期阻滞,且以后者更显著,P<0.001。流式细胞术检测提示,空白对照组与阴性对照组细胞在凋亡比率方面差异无统计学意义(P>0.05),而p53mut转染组细胞凋亡受抑制,p53wt和p16共转染组细胞凋亡增加,且以后者凋亡更多,P<0.001。结论过表达p53mut基因在H1299细胞中有显著的促癌作用;过表达p53wt基因在H1299细胞中有显著的抑癌作用,当p53wt联合p16共同过表达时,其抑癌作用进一步增强。