Klenow(exo-)的表达、活性测定及其在焦磷酸测序中的应用

野生的Klenow聚合酶具有3'-5'外切酶活性,会对引物进行切割而造成焦磷酸测序产生错误的延伸信号。为了制备缺失3'外切酶活性的Klenow聚合酶用于焦磷酸测序反应,该研究全合成了外切酶活性缺失突变的Klenow酶基因编码序列,将其插入到表达载体p ET28a(+)中构建重组质粒,并转化到大肠杆菌中,表达外切酶活性缺失的Klenow酶(Klenow(exo-))。通过优化诱导温度、诱导时间与诱导剂浓度,得到了Klenow(exo-)的最佳表达条件为30℃时诱导表达5 h且IPTG浓度为0.1 mmol/L。利用Ni+柱亲和层析法纯化得到了相对分子质量约为67 000的重组Klenow(exo-)酶,并建立了基于生物发光的酶活测定方法,最终将其用于焦磷酸测序反应。结果表明,制备的重组酶具有良好的聚合酶活性但缺失了3'外切酶活性,可成功测定DNA待测模板序列,为焦磷酸测序技术提供了一个有效的关键酶。