蛋白质异戊二烯化关键酶GGPPS结合小分子筛选模型的构建

蛋白质的基本翻译后修饰包括磷酸化、糖基化、乙酰化、棕榈酸化等^([1]),而异戊二烯化修饰是蛋白质的基本翻译后修饰之一,属于蛋白质的脂质修饰^([2]).甲羟戊酸途径中的关键分支酶——香叶基香叶基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)能够催化法尼基焦磷酸盐(Farnesyl diphosphate,FPP)生成香叶基香叶基焦磷酸盐(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP),介导蛋白质异戊二烯化的平衡^([3]).导致包括胰岛素抵抗^([4])、胰岛功能失调^([5])、生殖代谢异常^([6])等各种疾病的发生.GGPPS作为调节蛋白质异戊二烯化的重要靶点,因其在调节机体能量代谢稳态中的重要作用,促使构建筛选模型得到靶向GGPPS的小分子治疗药物,具有重要实践意义.实现EGFP荧光标记GGPPS原核蛋白的纯化以及表达,结合微量热泳动技术进行GGPPS结合天然化合物小分子的筛选模型构建.根据筛选模型对于检测蛋白稳定荧光的要求,分别构建含有GGPPS和EGFP基因的重组pET28a质粒以及对照质粒pET28a-EGFP.筛选高水平分泌表达GGPPS-EGFP-His蛋白的菌株,并对该菌株的目的基因整合位置及拷贝数进行测序.将含有目的基因的重组质粒的BL-21菌株大规模培养,表达的目的蛋白上带有His标签,利用镍(Ni)柱的亲和层析原理纯化获得重组蛋白GGPPS-EGFP-His,测定蛋白浓度留存.随后基于微量热泳动技术进行小分子结合筛选.重组GGPPS蛋白与梯度浓度化合物小分子在红外激光作用下发生热泳动,通过中心区域荧光检测可得出GGPPS与小分子化合物的结合状况.重组表达质粒GGPPS-EGFP-His经电泳及测序鉴定构建正确.纯化获得的重组蛋白纯度约为80%,在微量热泳动实验中,经GGPPS底物小分子法尼基焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate,FPP)浓度梯度测试呈现良好结合.重组蛋白GGPPS-EGFP-His能够在微量热泳动技术下显示与小分子底物FPP的结合,该系统的构建对于筛选出GGPPS结合天然化合物小分子以及靶向GGPPS的小分子治疗药物具有重要意义.