冬虫夏草菌丝体提取物调控免疫改善肾纤维化的实验研究

目的:观察冬虫夏草菌丝体(Hirsutella sinensis mycelium,HSM)提取物对盲肠穿孔结扎(CLP)小鼠的免疫反应和肾纤维化程度的影响。方法:建立CLP诱导脓毒症小鼠模型,分为假术组(sham,n=5)、模型组(CLP,n=11)、治疗组(HSM,n=11)。冬虫夏草菌丝体组在术前2小时和术后10天给予HSM提取物200 mg/(kg·d),假术组和模型组给予等量的生理盐水。利用流式细胞术分析了小鼠外周血中巨噬细胞、中性粒细胞和Treg细胞数量以及腹水中巨噬细胞数量;利用QPCR检测了肾脏组织中炎性因子TNF-α和IL-1β及纤维化因子TGF-β1、TIMP1和MMP9的表达;另外,还对肾脏组织切片进行了HE染色以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(fibronection)免疫组化染色。结果:模型组外周血中巨噬细胞、中性粒细胞和腹水中巨噬细胞数量较假术组显著升高,而HSM提取物治疗能下降上述细胞的数量;与正常组相比,模型组和治疗组外周血中Treg细胞数量均无明显差异;模型组肾脏组织中炎性因子TNF-α和IL-1β及纤维化因子TGF-β1、TIMP1和MMP9表达均上调,而治疗组肾脏上述细胞因子表达都有显著降低;HE染色显示模型组肾脏组织炎性样变明显,而治疗组有较好改善;与假术组比,模型组肾小管及间质α-SMA和fibronection表达明显增多,而治疗组肾小管及间质表达低于模型组。结论:HSM提取物具有调控免疫及改善肾纤维化的功能。

冬虫夏草菌丝体提取物通过抑制炎性因子及Treg细胞功能缓解肺纤维化

目的:观察冬虫夏草菌丝体(Hirsutella sinensis mycelium,HSM)提取物对盲肠穿孔结扎(CLP)小鼠的炎症反应和肺纤维化程度的影响。方法:建立CLP诱导脓毒症5 d和10 d小鼠模型,分别分为假术组(sham,n=5)、模型组(CLP,n=11)、治疗组(HSM,n=11)。冬虫夏草菌丝体组在术前2 h和术后给予HSM提取物200 mg/(kg·d)(低于人体用量0.27 g/kg),假术组和模型组给予等量的生理盐水。利用Q-PCR检测了肺组织中炎性因子TNF-α和IL-1β及纤维化因子TGF-β1、TIMP1和MMP9的表达;利用流式细胞术分析了小鼠外周血和脾脏中Th1细胞以及脾脏组织中Treg细胞的数量;另外,还对肺组织切片进行了HE染色以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(fibronection)免疫组化染色。结果:模型组外周血和脾脏中Th1细胞以及脾脏组织中Treg细胞的数量较假术组显著降低,而HSM提取物治疗能上调上述细胞的数量。5 d时,模型组肺组织中IL-1β及纤维化因子TGF-β1、MMP9和TIMP1表达显著上调,到第10天时有所降低但仍高于sham组,而治疗组上述因子表达明显降低;各组肺组织TNF-α表达无显著差异;HE染色显示模型组肺部炎性样变明显,到第10天时炎性样变比5 d时减轻,而治疗组均有改善;免疫组化显示与假术组比,模型组肺内间质α-SMA和fibronection表达明显增多,而治疗组肺内间质表达低于模型组。结论:HSM提取物具有抑制炎症、平衡免疫及缓解肺纤维化的功能。

IL-1β通过诱导TLR4表达增强协同LPS刺激引起的狼疮小鼠B细胞的功能异常

目的:探索IL-1β对SLE模型小鼠脾脏B细胞功能的影响。方法:磁珠分选纯化正常小鼠及SLE模型小鼠脾脏B细胞。用不同浓度的IL-1β或LPS联合IL-1β处理分选的B细胞后,CCK8检测B细胞增殖情况,流式细胞仪检测B细胞的活化及TLR4的表达,实时定量PCR方法分析细胞因子的表达。结果:获得的B细胞纯度高达95%。IL-1β不影响正常小鼠和SLE小鼠脾脏B细胞的增殖,也不影响共刺激分子CD80和CD86的表达。但IL-1β可上调SLE小鼠B细胞中CD40、CD69、IL-6及IL-10的表达。进一步,IL-1β与LPS协同可增强SLE小鼠B细胞的CD40及CD69表达。IL-1β还可上调SLE小鼠B细胞中TLR4的表达。结论:IL-1β可能通过诱导TLR4表达来增强LPS刺激引起的SLE小鼠的B细胞功能异常,提示控制感染和抑制炎症可能达到减缓SLE病程的目的。

JMJD3参与IFN-α和TLR7诱导的B细胞活化及凋亡

目的:探索组蛋白去甲基化酶JMJD3对B细胞活化和凋亡的影响。方法:磁珠分选纯化正常人及SLE患者外周血B细胞,用IFN-α、R848或IFN-α+R848处理纯化的B细胞,流式细胞仪检测CD86+或CD69+的细胞百分率以及CD86+Annexin V+或CD69+Annexin V+的细胞百分率;实时定量PCR和Western blot方法检测JMJD3的表达。结果:获得的B细胞纯度高达95%;IFN-α能够增强TLR7对B细胞的活化和凋亡;IFN-α也增加TLR7信号诱导的B细胞表达JMJD3,且JMJD3高表达依赖于MAPK通路,而不是NF-κB信号通路;SLE患者外周血B细胞高表达JMJD3,且JMJD3抑制剂能够抑制IFN-α+R848诱导的CD19+B细胞活化及凋亡。结论:JMJD3参与IFN-α和TLR7诱导的B细胞活化及凋亡,提示JMJD3抑制剂可能具有缓解SLE症状的作用。

冬虫夏草菌丝体提取物抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤

目的:探讨冬虫夏草菌丝体(Hirsutella sinensis mycelium,HSM)提取物对顺铂(CDDP)诱导的小鼠肾小管上皮细胞(RTEC)损伤的影响及可能的调控机制。方法:体外实验分5组:正常对照组、顺铂诱导的损伤模型组及低、中、高剂量的HSM干预组。RTEC经HSM预处理2 h后加CDDP刺激,24 h后收取细胞,分别采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡、Real-time PCR检测凋亡相关基因、炎性因子及模式识别受体的相对表达量。体内实验分3组:对照组、CDDP诱导的小鼠急性肾损伤模型组及HSM治疗组,分别取肾组织进行HE染色及提取RNA和相关基因mRNA水平的检测。结果:HSM预处理可缓解CDDP诱导的凋亡,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,并抑制BAX与Caspase-9;同时降低TNF-α和TLR4的表达。体内实验则显示HSM可有效缓解CDDP诱导的小鼠肾小管损伤。结论:HSM可以降低RTEC凋亡、减轻炎症以改善CDDP诱导的RTEC损伤。

脐带来源间充质干细胞对人B细胞系细胞的调控

目的:探讨脐带来源的MSC对B细胞生长、活化、功能、信号通路的影响,为阐明MSC对B细胞的调控以及作用机制提供理论基础。方法:以人非Hodgkin淋巴瘤B细胞系Daudi、Namalwa和Raji为研究模型,在CpG刺激和不刺激下,与脐带MSC分别共培养3天后,收集悬浮的B细胞,进行细胞计数,PI染色检测细胞周期,Annexin V染色检测凋亡;流式细胞仪检测表面免疫球蛋白、MHC分子和共刺激分子的表达,Transwell实验证明细胞接触的依赖性。实时定量PCR检测与MSC共培养6、12、24、48 h后细胞因子的mRNA水平。Western blot检测MAPK、JAK-STAT、PI3K信号通路蛋白的激活情况,抑制剂证明信号通路对细胞功能的影响。结果:MSC可阻滞Namalwa和Raji于G0/G1期,对3种B细胞系增殖和凋亡没有显著影响;显著抑制Daudi、Namalwa表面IgM的表达和3种B细胞表面CD86的表达,且抑制效应不依赖细胞接触和COX2的作用;显著上调Daudi内CCL2、COX2、IL-8的mRNA水平。但不影响TNF-α;显著激活3种细胞株上的ERK信号,ERK抑制剂可减弱MSC对Daudi表面分子和CCL2的调控。结论:MSC可阻滞B细胞系周期,通过分泌可溶性因子抑制B细胞系表面分子的活化、促进细胞因子的产生,ERK信号通路参与了MSC对B细胞系上述功能的调控,提示MSC抑制B细胞的免疫效应从而在治疗免疫疾病上发挥重要作用。

miR-30a影响MSCs的细胞周期及其对DCs的抑制作用

目的:间充质干细胞(MSCs)是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的多功能干细胞。已经有研究表明,miR-30a在一些免疫相关疾病的MSCs中的表达发生变化。但对于miR-30a如何调控MSCs影响其免疫调节功能还未有报道。本研究探究了miR-30a对MSCs的表型、活力、凋亡、周期和免疫调节功能的影响。方法:用混合酶法分离人脐带来源的间充质干细胞;用流式细胞仪分析了高表达miR-30a对MSCs表型的影响;用CCK-8法检测了miR-30a对MSCs的活力的影响;用Annexin V/PI双染法检测了高表达miR-30a后细胞凋亡的情况;用Q-PCR和蛋白质免疫印迹的方法检测了miR-30a对周期蛋白Cyclin E2(CCNE2)的影响;通过Targetscan预测软件分析miR-30a与CCNE2的靶向关系,并通过荧光素酶检测试验进行验证;另外通过MSCs与树突状细胞(DCs)共培养探讨了高表达miR-30a的MSCs对DCs的成熟的影响。结果:高表达miR-30a不影响MSCs的表型、活力和凋亡,但能抑制CCNE2的表达,使细胞周期阻滞在G0/G1期;进一步通过检测DCs的CD40和CD86表达发现,与普通MSCs相比,高表达miR-30a的MSCs能明显抑制DCs的成熟。结论:miR-30a可能通过抑制CCNE2表达影响MSCs的细胞周期,且miR-30a能增强MSCs对DCs的免疫抑制作用。

干燥综合征小鼠中MDSCs数量及功能变化

目的通过检测干燥综合征(Sjogren’s syndrome, SS)模型小鼠中髓系来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)数量及功能变化,旨在揭示干燥综合征发病机制,并为其临床治疗提供新依据。方法本研究选取公认的非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠作为干燥综合征模型,分别检测4、8、10和12周龄NOD小鼠唾液流量变化;HE染色观察NOD小鼠颌下腺淋巴细胞浸润情况;并采用流式细胞术检测不同周龄NOD小鼠MDSCs数量及功能变化。结果随着NOD小鼠干燥综合征病情的发展,其唾液流量逐渐减少,颌下腺淋巴细胞浸润灶的数量及浸润面积明显增加;外周血中MDSCs比例显著升高;与对照组小鼠相比具有SS样症状的NOD小鼠MDSCs表面的未成熟标志物表达量明显降低。结论 MDSCs数量和功能伴随SS的发展而改变。靶向MDSCs可能成为干燥综合征患者治疗的新靶点。

TLR7通路活化促进小鼠脾脏B细胞表达CD5

目的:探索TLR7通路的活化对小鼠脾脏B细胞表面抗原分子CD5表达的影响。方法:用TLR7激动剂R848刺激磁珠分选出来的小鼠脾脏B细胞,连续培养7天。首先用流式细胞仪检测CD5+IL-10+B细胞的动态变化;其次用流式细胞仪检测CD5+细胞比例和CD5分子的平均荧光强度(MFI)的动态变化;最后用抑制剂阻断TLR7下游各通路以探究TLR7上调B细胞表达CD5的分子机制。结果:TLR7激动剂能够上调CD5+IL-10+B细胞的比例;TLR7激动剂也能够促进小鼠脾脏B细胞表面抗原分子CD5的表达,包括CD5+B细胞的比例及CD5+B细胞表面MFI;进一步,TLR7下游通路阻断剂均能够抑制TLR7激动剂对小鼠脾脏B细胞表达CD5的促进作用。结论:TLR7能促进B细胞表达CD5,进而影响其IL-10分泌能力。

早期细胞凋亡引起活动期狼疮小鼠的B细胞比例下降

目的:探索活动期MRL/lpr狼疮小鼠中B细胞数量的变化及其调节机制。方法:利用流式细胞仪,首先分析了18周龄活动期MRL/lpr狼疮小鼠与正常C57/B6小鼠脾脏中B细胞的周期和B细胞占脾脏淋巴细胞的百分比;用Annexin V和PI标记方法检测了B细胞及其亚类凋亡情况;进一步磁珠分选纯化小鼠脾脏B细胞,实时定量PCR方法检测相关凋亡基因的表达变化。结果:与C57/B6小鼠相比,活动期MRL/lpr狼疮小鼠的B细胞比例明显减少(P<0.01),而凋亡比例显著增加(P<0.01),其中B细胞的早期凋亡比例增加(P<0.01),而晚期凋亡未改变;凋亡的B细胞包括未成熟和成熟B细胞。进一步发现,活动期狼疮小鼠B细胞中抗凋亡蛋白BIRC3明显降低(P<0.01),而促凋亡蛋白BCL2L1和BBC3(PUMA)明显增加(P<0.01)。结论:活动期狼疮小鼠B细胞的数目减少及早期凋亡的增加可能归功于抗凋亡与促凋亡蛋白的平衡改变,提示活动期SLE患者B细胞的减少可能与其早期凋亡相关。