1株侵染白三叶草的苜蓿花叶病毒全基因组序列分析及其寄主生物学研究

从杭州下沙公园种植的白三叶草中分离到1株苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)进行全基因组序列分析与寄主生物学研究。通过双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)提取和改进的单引物扩增技术对AMV-HZ进行全基因组克隆,并测序获得了病毒的全基因序列(Gen Bank登录号:RNA1,HQ316635;RNA2,HQ316636;RNA3,HQ316637);对AMV的外壳蛋白(coat protein,CP)序列进行了进化树分析,探讨了AMV病毒家族亲缘关系;设计了通用探针对AMV侵染进行了northern blot检测验证。AMV在心叶烟、本生烟、苋色藜、朝天椒上能形成侵染症状。为AMV的全基因组序列获得、分子检测和寄主生物学的研究提供了基础研究方法。

利用间歇浸没植物生物反应器进行半夏组培快繁的研究

研究了一种自主开发的间歇浸没式植物生物反应器进行三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit.)的组培快繁。首先考察了反应器的浸没频率对半夏培养的影响,利用正交试验设计了9组不同的浸没频率,经过8周的培养,对增殖倍数、生物量、组培苗外观形态进行考察,确定反应器培养半夏的最优浸没频率为5 min/12 h;其次,在反应器连续培养的过程中,检测培养液中pH值的变化,发现第4周是节点,在此之前pH逐渐降低,之后逐渐升高,说明营养消耗和代谢产物积累主导地位的变化发生在第4周,也可以说明在培养的第4周更换新鲜的培养基或进行培养基添加能够更好的培养半夏组培苗;最后,比较了反应器和固体培养在半夏组培快繁中的特点,通过对增殖情况、外观形态和组培苗活性成分含量考量,发现反应器培养的组培苗更加健壮。显示在半夏的组培快繁中能够即时换气和间歇浸没的液体培养方式比固体培养更有优势。本文为半夏的组培快繁提供一个新的技术和方法,为半夏和其它药用植物组培苗的规模化扩繁提供了借鉴。根据实验结果,对间歇浸没式植物生物反应器在种苗扩繁、抗性(耐盐)品种筛选和次生代谢产物研究方面的用途,进行了分析讨论。

华蒲公英组织培养技术研究

华蒲公英具有较强的环境适应能力,是植物抗逆性研究的优良材料。通过多因素分析种子最佳消毒时间,萌发、增殖和生根培养基的最适激素浓度。结果显示,最佳消毒方案为75%乙醇消毒30 s+无菌水冲洗2次+0. 1%升汞消毒10 min+无菌水冲洗5次,最佳萌发培养基的激素选择是6-BA 0. 2 mg/L、GA3 1. 0 mg/L,最佳增殖培养基的激素选择为NAA 0. 1 mg/L、6-BA 0. 5 mg/L,最佳生根培养基的激素选择是NAA 1. 0 mg/L。通过实验研究,筛选华蒲公英组培不同阶段的培养基配方,建立华蒲公英组培体系。

多种植物纤维复合制备纸质蛋盒及其静力学特性研究

研究了一种把大米草处理成热磨机械浆后,再与化学浆料复配,制备纸质蛋盒包装的方法,对所研制的蛋盒包装材料进行了静态压缩实验。结果表明:在相同湿度与温度条件下,利用瓦楞纸板浆制备的蛋盒材料承载性能最强,其最终承载能力达到了380N,利用废报纸浆复配40%(质量分数)大米草纤维以及纯白竹浆复配30%(质量分数)大米草纤维制备成的蛋盒,最终承载能力分别为302,300N,说明利用大米草复配化学浆料制备蛋盒包装材料具有良好的应用前景。

铁皮石斛组培体药用和营养成分含量的比较

为了探明铁皮石斛组培体中药用和营养成分含量,比较研究3种铁皮石斛组培体和人工栽培铁皮石斛干物率、多糖含量、总生物碱含量和总蛋白质含量。结果表明:三年生人工栽培铁皮石斛茎段干物率为20.79%,显著高于3种铁皮石斛组培体,原球茎干物率为3.77%,显著低于2种组培苗;三年生人工栽培铁皮石斛茎段多糖和总生物碱含量分别为24.66%和0.027%,均显著高于3种铁皮石斛组培体,原球茎多糖和总生物碱含量分别为11.53%和0.018%,均显著高于2种组培苗;3种铁皮石斛组培体总蛋白含量均显著高于三年生人工栽培铁皮石斛茎段(6.87%),原球茎总蛋白含量为22.19%,显著高于2种组培苗。综合而言,虽然铁皮石斛原球茎水分含量较高,但其增殖速率远大于人工栽培铁皮石斛和组培苗;在药用和营养成分方面,虽然铁皮石斛原球茎的多糖和总生物碱含量低于人工栽培铁皮石斛,但其多糖、总生物碱和总蛋白含量均高于2种组培苗。因此,铁皮石斛原球茎具有很好的开发应用前景。

十六倍体三叶半夏品种特性的分析

利用三叶半夏悬浮细胞为材料,通过秋水仙素诱导后获得稳定的半夏多倍体株系。通过染色体鉴定、生理分析以及药典规定项目的测定,综合考察半夏多倍体株系的品种特性,评价其作为新品种的潜力。结果表明:优良半夏株系为八倍体三叶半夏,加倍后的半夏为染色体加倍的十六倍体半夏。与八倍体半夏相比,十六倍体半夏在形态学方面表现出植株矮壮,叶片变圆变厚,块茎增大的特点,细胞学方面表现出气孔密度降低,保卫细胞增大,叶绿体个数增多的现象。经过种植实验得出结论:十六倍体半夏生长期延长,抗逆性增强,夏季基本不倒苗,并且块茎个体均一,品质较好,总体产量增加。对十六倍体半夏块茎进行测定比较后发现,十六倍体半夏符合药典中规定的各项定性和定量指标规定。由此可见,通过半夏的单细胞进行多倍体的诱导是一种可行的方案,并且诱导得到的十六倍体为抗性增强、产量提高,且符合药典规定的半夏新品系。

一株产油微藻——小球藻的纯化鉴定与培养基的筛选

从南京工业大学生物与制药工程学院获得一株小球藻藻种,经划线培养数代后,得到分离纯化的小球藻,18SrDNA鉴定确定其种属为普通小球藻。小球藻的常见几种培养基筛选结果表明,BG11培养基最适合该小球藻的生长。用牛粪浸出液代替传统培养基培养小球藻的梯度对照实验中,发现牛粪浸出液培养小球藻的效果很好,且浓度越高,生长状况越好。同时还对小球藻的粗脂含量做了测定,每克小球藻干粉中粗脂的含量约为0.206 g,占小球藻干重的20%左右。本研究为新能源的开发和利用积累了信息。

4种石斛在温州地区的栽培特性

对温州地区4种石斛人工栽培种的形态特征、抗寒性、折干率、多糖含量、总蛋白质含量及粗纤维含量进行比较分析,以确定适合温州地区种植的石斛品种。结果显示,铁皮石斛多糖含量最高,达11.83%;折干率也最高,达22.63%;抗寒性好,在温州地区可露天越冬;且铁皮石斛市场售价高,总体来说最适宜在温州地区大面积推广栽培。齿瓣石斛虽然抗寒性也较好,但是折干率和多糖含量不高,经济价值比铁皮石斛略低。兜唇石斛和杯鞘石斛产量高,但多糖含量低,粗纤维含量高,加之两者抗寒性差,因此不适宜在温州地区推广种植。

利用间歇浸没式植物生物反应器培养金钗石斛种苗

以金钗石斛(Dendrobium nobide Lindl.)原球茎为材料,利用间歇浸没式植物生物反应器进行金钗石斛组培快繁的研究。通过优化浸没频率、接种量和培养基蔗糖浓度,获得最佳的培养条件为:浸没频率5 min/8 h、接种量10 g·L^-1、蔗糖浓度20 g·L^-1,并与传统的固体培养比较,反应器培养在组培苗的生长形态、增殖倍数和有效成分上都明显优于固体培养。利用间歇浸没式植物生物反应器进行金钗石斛种苗培养,为金钗石斛种苗的高效率、低成本的生产提供了一种新的方法。

转基因棉花中棉41多重PCR体系的建立

利用多重PCR建立转基因棉花中棉41外源基因的检测体系。多重PCR技术的关键在于多重PCR反应条件的优化,本文从多重引物组合、PCR反应体系、PCR反应条件这三个方面对转基因棉花多重PCR反应进行优化,建立了扩增效率较高的中棉41的六重PCR反应体系,优化后的体系为HotstarTaq DNA聚合酶用量为1.25 U/50μL,镁离子的终浓度为3.5 mM,dNTP的终浓度为400μM,BSA(10mg/mL)的加入量为2μL,选取58℃为反应扩增的退火温度。利用优化的多重PCR体系特异性地检测到转基因棉花中棉41中的外源基因启动子CaMV 35S、终止子TNOS、报告基因NPTII和抗虫基因Cry1Ac。

盐胁迫对半夏组培苗生长及生理指标的影响

采用组织培养方法,在培养基中添加Na Cl提供盐环境,分别用盐浓度0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%处理3种半夏,处理后60 d测定各指标。结果表明,随着盐浓度升高,3种半夏组培苗生长情况总体表现为速度缓慢、增殖系数下降、生物量减少;细胞内有机渗透物质总体表现为可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛含量升高;总生物碱表现为先下降再升高;SOD酶活性呈上升趋势;确定Na Cl浓度为0.8%为半夏组培苗盐胁迫的临界浓度;低盐浓度(0.2%)不影响半夏组培苗生长,半夏属于轻度耐盐植物;半夏耐盐性筛选的直接指标为生长状态、增殖系数、生物量、干物率,间接指标为可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛、超氧化歧化酶活性;高盐浓度(0.8%、1.0%)胁迫下,生物碱可作为半夏的耐盐性筛选指标;耐盐性大小顺序为柳叶型半夏>多倍体桃叶型半夏>野生桃叶型半夏。

大蒜花苞的生物反应器扩繁

利用间歇浸没式生物反应器对大蒜花苞进行培养,研究了不同外植体类型对大蒜种苗生长的影响,并与传统固体培养方式进行了比较,随后对得到的微型鳞茎进行驯化栽培研究。结果表明：（1）不同生长阶段的大蒜外植体进行60 d的培养,反应器中Ⅱ型（固体培养基培养20 d的花苞）每个容器鳞茎数（942.40个）和增殖系数（23.56）均是Ⅰ型（新鲜花苞）的1.15倍;Ⅱ型每个容器生物量（8.82 g）和平均鲜重（0.22 g）均是Ⅰ型的1.1倍。因此,Ⅱ型比Ⅰ型花苞更适合作为间歇浸没式生物反应器培养的外植体。（2）生物反应器培养的外植体每个容器生物量（8.48 g）是固体培养基培养的70.67倍,平均鲜重（0.26 g）是后者的4.33倍,增殖系数（21.22）是后者的4.21倍,每个容器鳞茎数（848.80个）是后者的84.37倍。因此,间歇浸没式生物反应器培养方式优于固体培养基培养方式。（3）将生物反应器培养得到的微型鳞茎按照直径大小分为①型,4.0～6.0 mm;②型,3.0～4.0 mm;③型,〈3.0 mm。直径大小为3.0~4.0 mm的鳞茎,即②型发芽率最高,为68.11%,生根率和存活率分别为57.83%和85.73%,是水培鳞茎的适宜类型。利用育苗盘进行栽培,同样得到直径大小为3.0~4.0 mm的鳞茎表现最佳,其发芽率最高,为60.43%,生根率和存活率分别为58.43%和89.33%,鳞茎苗生长状态最好,是鳞茎栽培的适宜类型。

牛粪浸出液培养微藻系统优化及含油率分析

旨在研究利用牛粪浸出液对球藻生长及脂肪结累的影响。牛粪经处理,按浓度50 g/L浸出培养液,设计6个试验组(体积比为1∶9、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2、9∶1)及2个对照组对球藻进行培养,利用测定叶绿素总量计算其生长量,同时对藻种进行鉴定和脂肪含量测定。研究结果显示,通过18S rDNA分析本实验藻种属于普通小球藻;牛粪浸出液培养球藻适宜体积比为6∶4,且含脂率达0.57,远远高于BG11。结果表明牛粪浸出液可用于球藻培养,且是提高球藻脂肪含量的另一种途径。

三叶半夏丛生块茎途径扩繁及块茎分离技术研究

三叶半夏为传统常用中药材,有超过1 000 a的药用史。自然状态下繁殖效率较低,野生资源不足,因此人工繁殖半夏以满足社会需求就显得尤为重要。为解决以上问题,结合半夏块茎生长特点及传统组织培养操作获得了半夏的"丛生块茎途径",并考查了增殖条件、继代次数、变异情况、诱导分离基质等特性,结果表明:以Ms+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.0 g/L进行继代培养,前22代半夏丛生芽保持约15倍的增殖倍数,可作为扩繁的材料,同时需及时剔除变异组培苗,得到的丛生块茎种植于细沙或蛭石中,60 d后断水促使倒苗,筛除基质后即可得到大量栽培用单颗半夏块茎。

三叶半夏种质资源扩繁及保存研究

目的:通过对三叶半夏扩繁和保存方法的研究,为三叶半夏种质资源的保育和开发利用提供技术支撑。方法:首先,通过灭菌条件筛选、愈伤诱导及丛生芽诱导等进行扩繁条件探索;其次,通过设置不同基本培养基、蔗糖浓度、不同温度和光照强度等条件探索合适的种质保存条件;最后,探索了休眠块茎唤醒方式和丛生芽再诱导方法,为种质资源再扩繁提供基础。结果:以叶柄为外植体,升汞灭菌12 min后,接种至添加2,4-D的培养基中可诱导疏松愈伤组织。外植体接种至MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+蔗糖30 g/L+琼脂6.0 g/L,pH 5.8中可进行丛生芽诱导。合适的种质保存基本培养基为MS和N6培养基;合适的蔗糖浓度为30 g/L,过低或过高均不利于种质保存;在丛生块茎诱导时需要提供足够的温度和光照,低温及避光条件不利于种质保存。待丛生芽自然倒苗休眠后可进行长达1~2年的离体保存。对休眠块茎进行唤醒诱导时可采用切割块茎后再接种的方式。萌发出来的叶柄直接进行丛生芽诱导增殖,而块茎则接种至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L,pH 5.8中进行再分化诱导丛生芽。诱导出来的丛生芽进行规模化扩繁或继续进行离体保存。结论:通过对三叶半夏的种质扩繁,筛选合适的条件得到休眠丛生块茎,可对三叶半夏进行长时间的离体保存,而后唤醒和再次诱导的相关研究,为其种质资源保存、利用提供技术基础。

杜仲愈伤组织诱导及增殖培养技术研究

杜仲是我国名贵的中药材和最有开发前景的胶源植物。通过筛选外植体、优化培养基,建立杜仲愈伤组织诱导和增殖的培养体系,利用统计学方法进行分析。结果显示:以子叶、幼叶、下胚轴为外植体均能够诱导出愈伤组织,但较佳的外植体为下胚轴,诱导率达到79.33%;以下胚轴为外植体的愈伤组织诱导基本培养基是B5,较优的激素配比为NAA1.0mg/L+2,4-D2.0mg/L;愈伤组织增殖培养的较优激素配比为6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L。建立了杜仲愈伤组织的培养方法,为通过杜仲细胞培养获得代谢产物提供了技术支持。

两株铁皮石斛内生真菌对组培苗和原球茎生长的影响

在铁皮石斛内生真菌的研究中,获得了对组培苗的生长呈现不同影响的两株内生真菌DCN-1和DCN-3,为探究其对组培苗和原球茎生长的影响,首先对已分离纯化的菌株DCN-1和菌株DCN-3进行菌株形态和ITS1-5.8S-ITS2区段序列鉴定;采用孢子悬浮液注射和菌丝体附着伤口的方法对铁皮石斛组培苗和原球茎进行接种,观察组培苗的生长情况;参照柯赫氏法则对菌株进行重新分离,并结合切片观察结果验证侵染情况。结果显示:菌株DCN-1和菌株DCN-3分别与Myceliophthora verrucosa、G ibberella moniliformis的相似度最高,其中菌株DCN-1对组培阶段和移栽后的组培苗和原球茎的生长无明显影响,菌株DCN-3会导致组培阶段的植株苗枯萎甚至死亡而对移栽后的组培苗影响不大,但抑制原球茎的生长。徒手组织切片观察及二次分离结果分析显示:两株内生真菌均成功侵染植株体内,并确定相应植株的生长状况与该两株内生真菌的侵染相关。两株内生真菌在在营养较丰富的组织培养条件下对铁皮石斛组培苗和原球茎造成不同的影响,为探究其与铁皮石斛的相互作用和促进铁皮石斛植株生长及有效活性物质产生的复合型菌制剂提供了依据。

三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)的间歇浸没培养

目的:利用间歇浸没培养反应器对药用植物三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)进行组培快繁研究。方法:以增殖倍数、鲜重、平均鲜重、折干率和组培苗状态为指标,一方面对三叶半夏叶片、叶柄及丛生芽体进行培养,考察适合间歇浸没培养的外植体类型;另一方面以叶柄为外植体对三叶半夏进行间歇浸没培养、固体培养和液体摇瓶培养,考察三种培养方式对其生长的影响。结果:不同的外植体在反应器内培养时,从增殖情况来看,丛生芽作为外植体得到的增殖倍数高达39.15,叶柄为27.65,叶片为18.05。鲜重方面与增殖倍数具有相同的规律。从平均鲜重和折干率来看,无显著差异。由组培苗形态来看,以叶柄诱导的组培苗最为健壮,而以丛生芽诱导的组培苗则较为细弱。不同培养方式下的增殖倍数分别为:间歇浸没培养方式最高为24.73,其次固体培养为14.75,液体摇瓶培养为12.26,差异显著。平均鲜重和折干率均为间歇浸没培养最优。由组培苗形态来看固体培养优于间歇浸没培养,反应器得到的组培苗较为细弱。在保卫细胞长宽和叶绿体个数上两者没有显著性差异。而液体摇瓶培养玻璃化导致叶绿体个数减少,不适合培养三叶半夏的。结论:较适合间歇浸没培养的外植体类型为叶柄和丛生芽,以叶柄为优。间歇浸没培养方式相对于传统的固体和液体培养在各项生理指标上表现较好,具有大规模培养三叶半夏的潜力。

间歇浸没式生物反应器培养铁皮石斛组培苗

目前铁皮石斛种苗生产主要采用植物组织培养的方法,传统的固体培养方式成本高效率低,无法满足市场需求,利用间歇浸没式生物反应器可以减少人工投入,降低生产成本。利用自主研发的间歇浸没式生物反应器培养铁皮石斛种苗,同时以固体培养作对照,比较了两种培养方式的铁皮石斛增殖率及植株高度、茎粗、根系情况、移栽成活率等。结果显示间歇浸没式生物反应器培养获得的铁皮石斛增殖率更高,组培苗更健壮,而且根系适中,利于栽培,移栽成活率也高于固体培养,为铁皮石斛种苗生产提供了一种新的方法。

三种荆州半夏的ITS序列分析与种属鉴定

通过采集自湖北荆州地区的三种不同表现型的半夏属植物的叶片组织中提取基因组,纯化后经直接PCR扩增得到其对应的ITS序列并测序。运用NCBI Gen Bank数据库进行序列比对与进化树分析。根据比对与分析结果,结合植物形态学特征显示,HBB-01为Pinellia ternata,为《中国药典》中规定的半夏类药材品种;HBD-02为P.tripartita,为药用半夏的混淆品;HBF-03的结果较为复杂,其不仅与芋属(Colocasia)天南星属(Arisaema)、半夏属(Pinellia)等植物ITS序列的同源性高达80%以上,而且在进化关系上,它们也有一定关联。所以推测HBF-03可能为天南星科不同属但亲缘关系较近的植物产生的变种,具体种属来源有待进一步论证。通过三种半夏种属来源及其亲缘关系的分析,鉴定了荆州地区的半夏人工种植的主要品种,对其当地药农种植符合《中国药典》规范的半夏药材具有指导意义,为后续优质半夏资源的保护与选育提供了参考依据。