由Egr-1调控TK基因灭活胰腺癌细胞的实验研究

目的:观察对放射敏感的早期生长反应基因-1(early growth response-1,Egr-l)启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,TK)基因是否对胰腺癌细胞的杀伤作用有增敏效应。方法:以细菌内同源重组法构建含TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胰腺癌细胞株PC-3,60Co-γ射线照射后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA的表达。加入前药丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV),MTT法检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用。结果:经60Co-γ射线照射后,与对照组胰腺癌细胞(0.86±0.11)相比,前药GCV可明显提高对转染pAdEgr-1-TK胰腺癌细胞的杀伤效率(0.08±0.03)(P<0.001)。结论:由Egr-l启动子调控的TK自杀基因在γ射线作用下可以显著提高杀伤胰腺癌细胞的能力。

辐射诱导性自杀基因对胰腺癌体内治疗效果的实验观察

目的将PC-3胰腺癌细胞种植于balb/c裸小鼠皮下,建立移植瘤模型,观察pAdEgr-1-TK注入后在射线和前药GCV下对胰腺癌的治疗作用。方法PC-3胰腺癌细胞以1×107混以0.1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)皮下接种于balb/c裸鼠皮下,每组6只,共4组24只,待肿瘤长至约0.6 cm时,分为4组,以PC-3组作为对照,PC-3/pAdE组注射同量混以PBS的pAdEgr-1,PC-3/pAdET(不放射)和PC-3/pAdET(放射)组将纯化腺病毒pAdEgr-1-TK以1×109 pfu/ml、0.1 ml/只直接注射到治疗组肿瘤体内,1次/d,连续3 d,同时,腹腔内每日注射GCV(25 mg/kg),连续14 d,即分两次间隔48 h行剂量为10 Gy的60Co-γ射线照射,观察各组动物肿瘤生长情况,每3天测量肿瘤体积[(长径×短径2)/2],治疗结束后,处死裸鼠,取瘤体称重,并在光镜下观察肿瘤的病理结果变化。结果4组细胞接种后,balb/c裸小鼠均成瘤,成瘤潜伏期无差异,成瘤率为100%,治疗前(60Co-γ射线照射+GCV),四组动物瘤体大小无差异(P=0.824),治疗后,观察对照组肿瘤生长迅速,治疗组肿瘤生长明显减慢,体积和质量PC-3/pAdET(放射)组均明显小于其他3组(P=0.000)。结论成功建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,体内实验证实Egr-1基因启动子在射线作用下可驱动下游TK自杀基因表达而对胰腺癌起治疗作用。

携带Egr-1基因调控序列的TK基因的腺病毒载体的构建

目的:构建以GFP做标志基因的放射敏感基因Egr-1调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpssimplexvirusthymidinekinase,TK)的腺病毒载体。方法:以PCl-neo-Egr-1-TK(pET)为模板扩增Egr-1,插入到pAdTrack的XbaI和XhoI位点,构建重组质粒pAdTrack/Egr-1;与pET酶切获得TKcDNA相连,构成pAdTrack/Egr-1-TK;用PmeI酶切后与pAdEasy-1混合,应用细菌内同源重组法获得重组表达质粒pAdEgr-1-TK。结果:重组表达质粒pAdEgr-1-TK的酶切鉴定符合预期结果,感染肿瘤细胞可见绿色荧光表达。结论:通过细菌内同源重组成功构建含GFP做标志基因的pAdEgr-1-TK重组表达质粒,为研究Egr-1调控自杀基因及对肿瘤细胞进行灭活打下了基础。

辐射调控性TK基因载体在胃癌细胞中的表达

目的利用放射敏感基因早期生长反应基因1(Egr-l)启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK),观察其在胃癌细胞中的表达。方法以细菌内同源重组法构建含TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胃癌细胞株MGC-803,分别以0、5、7.5、10、15、20Gy剂量γ射线照射,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析,比较TK基因的mRNA表达。结果转染后的胃癌细胞株经射线照射后其TK mRNA的表达较未照射组(56.4±1.46)%有明显提高,以10Gy最为显著(132.3±2.18)%,(P<0.01)。结论经γ射线照射后,射线激活Egr-l启动子可引起TK基因在胃癌细胞中高效表达,为进一步研究胃癌的放化疗提供了依据。

辐射诱导性自杀基因在胰腺癌细胞中的表达

目的利用辐射敏感的早期生长反应基因1（Egr-1）启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-TK），观察其在胰腺癌细胞中的表达效果。方法以细菌内同源重组法构建含绿色荧光蛋白（GFP）做标志基因的TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK，转染人胰腺癌细胞系PC-360Co-γ射线照射后，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA表达。Western印迹法分析60Co-γ射线照射后转染pAdEgr-1-TK细胞中TK蛋白质的表达量。结果重组腺病毒载体pAdEgr-1-TK转染胰腺癌细胞系PC-3，不同剂量60Co-γ射线照射后，经RT-PCR半定量分析，TKmRNA表达结果分别为0Gy（67．3±2．1）％、5Gy为（89．3±1．0）％、7．5Gy为（114．7±5．7）％、10Gy为（140．5±3．1）％、15Gy为（134．5±4．0）％、20Gy为（117．4±3．4）％，各照射组TKmRNA表达均明显高于对照组0Gy（均P〈0．01），尤以剂量为10．0Gy时最为显著。Western印迹分析结果分别为0Gy为（5．4±0．7）％，5Gy为（7．6±0．9）％，7．5Gy为（21．5±1．5）％，10Gy为（35．7±1．4）％，15Gy为（32．1±1．2）％，20Gy为（28．8±1．5）％，60Co-γ射线照射可明显提高转染pAdEgr-1-TK细胞中TK的蛋白质表达量，且蛋白质表达量与辐射剂量呈正相关性。结论放射敏感性启动子Egr-1基因可驱动TK自杀基因在胰腺癌细胞中高效表达。