枯草芽孢杆菌醛缩酶的克隆表达、纯化、酶学性质研究及应用

果糖-1,6二磷酸醛缩酶是糖酵解途径中的关键酶,可催化果糖-1,6二磷酸(FDP)分解成磷酸二羟丙酮(DAP)和三磷酸甘油醛(G3P)的可逆反应.本文首次克隆枯草芽孢杆菌中的果糖-1,6二磷酸醛缩酶基因(fba),构建原核重组表达载体,利用Ni-NTA柱对重组枯草芽孢杆菌果糖-1,6二磷酸醛缩酶(FBA)进行分离纯化和酶学性质研究,构建表达载体pET28a(+)-fba转化入BL21(DE3)宿主内,在30℃下诱导表达,通过SDSPAGE检测FBA纯度和分子量,FBA分子量约为35 kDa.最适反应条件为pH 7.5、35℃,金属离子K^+、Na^+、Fe^(2+)对该酶有较好的激活作用,而Zn^(2+)、Mn^(2+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)对该酶有一定的抑制作用.基于FBA可专一性分解FDP的基本原理,建立了快速、准确测定酵母发酵液中FDP含量的单酶法.通过单酶法测定FDP含量的样品回收率为99.54%,相对标准偏差为0.427%,测定结果基本不受样品中其他成分干扰.T检验结果表明,单酶法和多酶法对发酵液中FDP含量的检测结果无显著差异,与紫外分光光度法测定的结果存在显著差异,这说明单酶法可以准确测定发酵液中FDP的含量.单酶法测定FDP含量具有快速、准确、灵敏的特点,不仅适合于成分复杂的发酵液中FDP含量的测定,也具有广泛的应用价值.

CD11b调控LPS刺激下巨噬细胞表达IL-12的分子机制

CD11b是白细胞整合素家族成员之一,在炎症的发生和发展中发挥重要作用.在内毒素血症小鼠模型,发现脂多糖(LPS)导致外周血白细胞介素12(IL-12)水平降低,而CD11b抑制剂能防止此现象发生.为阐明CD11b调控LPS刺激下IL-12产生的分子机制,本文利用RAW264.7细胞开展了进一步研究.酶联免疫吸附、实时定量PCR和Western Blot等检测结果表明,CD11b可抑制LPS刺激下RAW264.7细胞IL-12的表达;利用sh RNA敲低CD11b的表达则能提高LPS刺激下RAW264.7细胞IL-12p35、IL-12p40的转录水平和蛋白水平的表达;JNK和NF-κB信号通路与CD11b调控IL-12的产生关系密切,而p38、ERK信号通路影响较小.因此,研究结果提示,CD11b通过JNK和NF-κB信号通路抑制LPS刺激下巨噬细胞IL-12的产生,抑制CD11b的功能可能有助于削弱LPS引起的炎症反应.

抗CD3×CD87单链双特异抗体介导的单个核细胞对前列腺癌细胞杀伤作用的体外研究

本研究尝试探讨抗CD3×CD87单链双特异抗体介导的单核细胞对CD87+前列腺癌细胞的杀伤作用.首先,利用基因工程手段,构建了pET24a/抗CD3×CD87单链双特异抗体原核表达载体;将重组载体转化BL-21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达;获得的工程菌经超声破碎,先在变性条件下亲和纯化目的蛋白,再采用稀释复性方法对scBsAb进行复性.其次,利用流式细胞术检测表达纯化的scBsAb与两种相应抗原的结合情况.最后,通过CCK-8法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对CD87阳性前列腺癌细胞PC-3的杀伤效应.结果表明,利用基因工程手段获得了较高纯度的scBsAb;scBsAb能与PC-3细胞表面CD87特异性结合,并且能与CD3特异性结合;scBsAb的浓度及效靶比影响scBsAb介导的杀伤作用.在效靶比为10∶1,scBsAb浓度为100μg/mL时最大杀伤率达到40.86%;在scBsAb浓度为100μg/mL,效靶比为40∶1时达到最大杀伤率60.9%.此外,ELISA检测表明,在scBsAb介导的PBMCs靶向CD87阳性肿瘤细胞杀伤过程中IFN-γ的水平显著增高.结果证明,scBsAb能够在体外有效介导效应细胞杀伤CD87阳性肿瘤细胞.

GGT酶法合成γ-谷氨酰半胱氨酸

以大肠杆菌K-12基因组中克隆表达的γ-谷氨酰转肽酶作为催化剂,L-谷氨酰胺和胱氨酸为底物合成γ-谷氨酰胱氨酸,经还原生成γ-谷氨酰半胱氨酸.考察反应时间、酶浓度、补料方式等可能对酶促反应过程产生影响的因素,在L-谷氨酰胺0.1 mol/L、胱氨酸0.2 mol/L、酶浓度0.024 U/m L及p H为10.0的条件下,40℃反应12 h,γ-谷氨酰半胱氨酸的最大浓度为6.13 g/L,L-谷氨酰胺的最大转化率为24.5%.