杨树干旱胁迫响应转录因子的研究进展

转录因子是杨树干旱胁迫应答分子调控网络中的重要组成部分之一,通过特异性结合干旱响应相关基因启动子区的顺式作用元件,调控下游靶基因的转录表达,从而参与杨树干旱胁迫响应过程。杨树WRKY、NAC、bZIP、MYB和AP2/ERF是干旱胁迫响应分子机制研究中最主要的五大转录因子家族,每个家族拥有超过80个成员。本文简要介绍了杨树干旱胁迫转录组学研究进展,系统总结和概括了杨树这五类转录因子的结构特征与亚家族分类、调控下游靶基因表达的方式及其在参与调控干旱信号转导网络中的作用等方面的研究进展,并对存在的问题与未来研究进行展望,旨在深入了解杨树耐旱分子机理,为培育抗旱型杨树新品种提供参考。

杨树ARGONAUTE基因的克隆及序列分析

作为RNA诱导沉默复合体的核心元件,Argonaute(AGO)蛋白在植物生长发育过程中发挥着重要作用。以欧美杨和美洲黑杨不定根cDNA为模板,采用RT-PCR技术分离得到PeAGO5和PdAGO5基因的cDNA克隆,测序和序列分析结果表明2个目的cDNA片段均为2809bp,基因内部含有完整的开放阅读框,可编码907个氨基酸,预测蛋白质分子量分别为102.31ku和102.34ku,理论等电点(pI)分别为9.34和9.7。所推导的2个氨基酸序列之间仅有7个差异位点,含有3个保守的结构域,DUF1785、PAZ和Piwi结构域。它们与拟南芥AtAGO5蛋白的相似性分别为64.8%和64.3%,故将其命名为PeAGO5和PdAGO5。系统进化分析发现,PeAGO5和PdAGO5,与拟南芥AtAGO1,AtAGO5和AtAGO10蛋白同属一个进化分支。此外,采用实时定量PCR技术检测PeAGO5基因在杨树硬枝插穗不定根发育过程中的表达模式,推测该基因参与不定根发育调控。

一个杨树第V类几丁质酶基因的克隆及表达分析

几丁质酶是一种重要的糖苷酶，在植物抗生物及非生物胁迫的过程中发挥了重要的作用。根据序列差异及所含结构域的不同，杨树中的几丁质酶可以分为5类。其中关于第V类几丁质酶的研究最少。本研究在加拿大杨中克隆到了一个第V类几丁质酶基因PcCHl3。序列分析的结果显示，该基因eDNA全长1303bp，含完整的开放阅读框，可编码366个氨基酸。预测蛋白质分子质量为39．53kD。理论等电点（pI）为5．49。PcCHl3与苦瓜、烟草、梨的第V类几丁质酶在系统进化树上同属一个分支。对PcCHl3在逆境胁迫及病原真菌诱导下的表达模式进行分析后发现，该基因可以被杨树病原真菌杨生褐盘二孢菌强烈诱导（可达对照的83倍），在干旱胁迫及盐胁迫的条件下表达量也出现了较大的上调（为对照的4～5倍）。研究结果为杨树几丁质酶功能的系统进化及林木抗性育种研究建立了一定基础。

杨树抗杨四瘿螨相关基因的表达分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,在构建杨四瘿螨诱导差异表达的抑制消减cDNA文库的基础上,通过RT-PCR技术对候选基因进行了验证,其中有6条差异表达候选基因在4个时间点表达量有明显的增强。运用RACE(Rapid Amplification of cDNAEnds)技术克隆获得了一段全长2 053 bp的cDNA克隆,命名为PtWRKY,编码588个氨基酸。

植物细胞壁伸展蛋白研究述评

结构蛋白是细胞壁的重要组成成分。最早发现的细胞壁结构蛋白是伸展蛋白,它在初生壁中约占壁干质量的1%～15%。广义的伸展蛋白是一类富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP),狭义的伸展蛋白则特指具有Ser-Hyp4重复模体的HRGP分子。以往的研究发现伸展蛋白主要功能是控制细胞的正常伸展,增强细胞壁的机械强度。近年来在拟南芥中进行的伸展蛋白基因缺失突变研究结果显示,伸展蛋白也参与细胞壁的初始形成过程,这是不同于以往对细胞伸展蛋白认识的新发现。伸展蛋白翻译后修饰包括脯氨酸残基羟基化、羟脯氨酸与丝氨酸残基糖基化,在过氧化物酶催化下,形成分子间与分子内交联,通过直链和支链连接进行分子组装。由于伸展蛋白是细胞壁结构蛋白的主要组成成分,研究伸展蛋白的结构和功能对更好地了解细胞壁结构及其组装具有重要意义。

林木遗传育种基础研究热点述评

林木由于世代周期长、个体高大、遗传负荷高等自身固有的一些特性,一直被认为是一种非常难以操作的遗传学材料,导致林木遗传育种在基础研究方面远远滞后于模式动、植物和其他重要作物,成为限制林木遗传改良进程的主要因素。分子育种是突破林木育种周期长的关键技术,通过基因组学研究,分析和阐明林木基因的功能是进行林木分子育种设计的前提。近年来随着生命科学领域新技术的快速发展,林木遗传育种基础研究也出现一些新的热点。本文主要阐述林木基因组和功能基因组学、连锁与关联分析、木材形成机制及分子育种技术的研究进展,虽然目前相关研究成果实际应用的条件还不成熟,但作为技术储备是急需加强的研究方向。

造纸白水中的细菌多样性及系统发育树分析

在制浆造纸过程中,白水的循环回用加重了纸机微生物污染的问题,促进了纸机腐浆的形成,影响了纸机的正常运转。此次研究用滤膜抽滤富集细菌菌体,对白水样品直接提取DNA,通过16S rDNA序列分析,构建16S rDNA文库,对芬欧汇川(UPM)常熟纸厂PM1纸机白水中的细菌多样性进行了研究。获得的61个16S rDNA序列可分为28个可操作分类单元(OTUs),分属于6个不同门类,优势菌种顺序为变形菌门(Proteobacteria)(77.05%)、厚壁菌门(Firmicutes)(11.48%)、放线菌门(Actinobacteria)(4.92%)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)(3.28%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(1.64%)、蓝藻门(Cyanobacteria)(1.64%)。造纸白水具有较丰富的细菌多样性,以变形菌为优势菌群,占库容总量的77.05%,其中尤以β-变形菌群为主,占库容总量的45.90%,而首次在中国纸机鉴定出的水生施莱格尔氏菌(Schlegelella aquatica)为克隆文库的优势菌株,另外还含有2个菌种属于异常球菌-栖热菌门,该菌门为红色腐浆形成菌种。

位点特异性DNA内切酶在植物基因打靶中的应用

基因打靶是在基因组指定位点插入、删除和替换DNA序列的技术。由于同源重组频率低,在植物中高效的基因打靶技术一直未被建立,制约了植物基因功能和分子育种的研究。近年来,人工设计的锌指蛋白和TAL效应因子DNA结合结构域实现了对全新DNA序列的识别。人工设计的DNA结合结构域连接核酸内切酶能在基因组指定位点创造双链DNA断裂,进而产生定点突变和促进同源重组。笔者重点介绍锌指核酸酶和TAL效应因子核酸酶在植物基因组定点突变和基因打靶中的研究进展,并对目前存在的问题进行分析。

基因组选择在林木遗传育种研究中的进展与展望

基因组选择技术是目前动植物遗传育种的关键技术和研究热点,已在一些动植物的遗传改良工作中取得了重要进展。林木具有世代间隔长的生物学特性,因而育种周期长,早期选择是缩短林木育种周期和加快林木育种进程的有效方法。林木早期选择研究可以粗略分为3个阶段:基于性状表型早晚期相关的早期选择、分子标记辅助选择的早期选择以及基因组选择。林木遗传改良的目标性状主要是生长性状和木材品质性状,其大都是复杂的数量性状,在生长进程中受到更加持久的环境影响。同时生长性状的遗传力是随着生长进程而发生变化的。基因组选择在林木遗传改良中的应用受限于多年生林木自身特点以及研究基础薄弱,包括世代间隔长、体型高大、幼龄期长、基因组和表型组等组学数据匮乏以及相关研究技术平台不完善等因素。为了推动基因组选择技术在林木遗传改良中的应用进程,本文介绍基因组选择技术的原理与方法,总结基因组选择技术在林木遗传育种中的研究进展,探讨基因组选择技术在林木遗传改良中应用的限制性因素。简要介绍基因组选择的线性模型、统计学估计方法(SNP-BLUP、GBLUP和Bayesian估计模型)和分析工具(rrBLUP、synbreed、BGLR、GVCBLUP、GAPIT、sommer和BLUPGA,等)。概括总结基因组选择技术在林木育种中应用的优势,简要概述阔叶树种(杨属、桉属、油棕属和橡胶树属)和针叶树种(松属和云杉属)的基因组选择研究案例,以油棕基因组选择研究作为典型案例分析。林木树种的基因组选择研究案例均表明基因组选择技术有助于提高林木选育效率和加快林木育种进程。深入探讨林木树种的参考基因组、全基因组关联分析、育种群体、连锁不平衡和多年生属性5个方面对林木基因组选择研究的影响。基因组选择在林木遗传育种研究中具有潜在应用前景,但其可行性仍需要大量的模拟数据和真实数据评估。当前林木基因组选择研究所面临的重要问题:1)林木树种的基因组组装质量普遍不高;2)如何开展林木多性状全基因组选择研究;3)针对多年生林木树种自身特点,设计出合理的试验方案,开发具备纵向性状数据处理能力的统计模型和分析软件。

杨四瘿螨诱导的美洲黑杨抑制消减文库的构建及分析

采用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术，以杨四瘿螨诱导48、72h的美洲黑杨无性系为实验方（tester），以未经诱导的美洲黑杨无性系为驱动方（driver）构建杨四瘿螨诱导差异表达的抑制消减cDNA文库，共获得了710个克隆，所建cDNA文库的插入片段主要集中在200～1000bp之间。通过序列测定拼接和同源性对比分析，获得了美洲黑杨涉及信号传递、能量代谢、胁迫响应、物质运输等功能的差异基因。

美洲黑杨生长变异与无性系选择

从美洲黑杨原产地密西西比州、得克萨斯州和路易斯安娜州等地引种了104个无性系,并于1998年春在江苏省泗洪县陈圩林场开展无性系对比试验造林。12年生试验结果表明,来自于密西西比州和得克萨斯州7个产地89个无性系长势较好,路易斯安娜州的15个无性系长势较差。树高、胸径和材积等3个生长性状在无性系间差异极显著,性状遗传力（0.552 3~0.658 7）较高,遗传变异系数（8.26%~31.61%）较大。在入选率为5%,选择强度为2.02条件下,材积生长量的选择增益为50.82%。选择的S3412等5个速生无性系12年平均单株材积生长量为1.021 1 m3,超过对照（CK）品种I-69杨15.05%。

基于SLAF-seq技术的抗杨树叶锈病SNP位点开发

【目的】探索美洲黑杨抗叶锈病的分子机制,为杨树抗病分子育种提供理论参考。【方法】选取抗锈病差异显著的美洲黑杨‘2-2’与‘2-38’为亲本,通过控制授粉杂交获得80个F1代个体。用特异性位点扩增(specific-locus amplified fragmenl sequencinq, SLAF-seq)简化基因组技术对所获F1代进行深度测序,以美洲黑杨第3代组装基因组为参照。通过序列比对筛选特异长度的DNA片段,构建SLAF-seq文库,获得特异性SNP位点。经美洲黑杨叶锈病的病原菌经形态学与分子工具鉴定,确定为落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina Kleb.)。通过叶盘法控制条件接种并对被锈菌侵染后的杨树抗性进行评估;应用Kruskal-Wallis方法对接种结果进行检验。【结果】通过接种,获得了孢子堆数量和大小等表型数据;基于SNP标记的连锁分析,一共有8 723个SNP连锁至遗传图谱上;共识别出19个连锁群,总遗传距离为3 610.67 cM;通过Kruskal-Wallis检验可得到37个紧密连锁位点(P<0.005),标记分别位于I、IV、VI、XI、XV和XIX号连锁群上。【结论】利用SLAF-seq技术开发出了37个与杨树叶锈病抗病性状紧密关联的SNP分子标记,其中Marker42056位点连锁程度最高。