精液中性粒细胞弹性蛋白酶的研究进展

影响男性生殖的因素很多,生殖道感染是其中重要因素之一。精液中性粒细胞弹性蛋白酶(polymor-phonuclear neutrophil elastase,PMNE)作为男性生殖道感染尤其是隐性感染诊断的重要炎症指标,对男性生育能力有潜在的负面影响。精液PMNE浓度不仅与精液白细胞数、精浆ROS水平显著相关,而且与其他炎症相关细胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α水平等密切相关。PMNE对精子质量亦有影响,可以削弱精子活力,影响精子形态和DNA完整性等。精液中存在PMNE抑制剂,可与PMNE形成复合物,两者比例的失衡可以促进慢性炎症的发生,进而可能导致男性不育。检测精液PMNE的方法主要为酶免疫分析法,但检测方法仍需标准化,诊断标准尚需统一。

精浆α葡糖苷酶全自动检测方法的建立及评价

目的：建立精浆α葡糖苷酶活性全自动检测方法并对其准确性、重复性和线性范围等进行评价。方法：利用速率法检测精浆α葡糖苷酶活性,并在全自动生化分析仪上建立检测参数,并评估该方法的试剂空白吸光度、准确性、重复性和线性范围。结果：试剂空白吸光度平均为0.002 14,空白吸光度变化率（△A/min）平均为0.015 26。3份高、中、低α葡糖苷酶活性的精浆样本重复测定10次的CV值分别为2.52%、0.36%和0.76%。采用比对试验的方法来评价准确性,40份精浆标本每个浓度点的相对偏差范围为-5.52%~7.54%,均低于15%的要求。精浆α葡糖苷酶活性在76~647 U/L范围时,具有良好的线性关系（r〉0.99）。结论：本研究建立的全自动精浆α葡糖苷酶活性检测法有较低的试剂空白,重复性和准确性较好,且有较宽的线性范围。该法操作简单、快速,精浆样本无需稀释,适合临床上大批量样本的检测筛查,大大节省了人力和试剂成本。

全自动精浆γ-L-谷氨酰转肽酶检测方法的建立及评价

目的：建立精浆γ-L-谷氨酰转肽酶（GGT）全自动检测方法并对其准确性、重复性和线性范围等进行评价。方法：利用速率法检测精浆GGT活性，并在全自动生化分析仪上建立检测参数，并评估该方法的试剂空白吸光度、准确性、重复性和线性范围，同时与目前临床上常用的精浆GGT检测化学比色法试剂盒（南京欣迪）进行比较。结果：试剂空白吸光度平均为0．0476，空白吸光度变化率（AA／min）平均为0．000168。3份高、中、低GGT活性的精浆样本重复测定10次的变异系数值分别为0．26％、4．83％和1．60％。采用比对试验的方法来评价准确性，40份精浆标本每个浓度点的相对偏差范围为-13．38％-11．05％，均低于15％的要求。精浆GGT活性在299～1833U／L范围时，具有良好的线性关系（r〉0．99）。以精浆GGT检测化学比色法试剂盒作为对照试剂，全自动检测法作为试验试剂，两者对115例精浆样本的检测结果呈显著正相关（r=0．981，P〈0．01），Kappa值为0．776（P〈0．05），符合率为90．43％。结论：本研究建立的精浆GGT全自动检测法有较低的试剂空白，重复性和准确性较好，且与目前临床上使用的化学比色法有很好的一致性。该法操作简单、快速，精浆样本无需稀释，适合临床上大批量样本的检测筛查，大大节省了人力和试剂成本。

一种可反映人精子DNA损伤严重程度的流式细胞术的建立及评价

目的:建立一种可反映人精子DNA损伤严重程度的流式细胞检测技术,并对其性能进行评价。方法:DNA损伤精子(单链DNA)与荧光染料吖啶橙(AO)结合后发红色荧光,而DNA完整精子(双链DNA)与AO结合后发绿色荧光。通过对1165例人精液样本正常精子群的红色荧光和绿色荧光峰图的分析,确定红色荧光的95%的平均上限和绿色荧光的5%的平均下限为十字象限门的红色荧光和绿色荧光界限,建立精子DNA碎片指数(DFI)的流式细胞检测技术,并分析其重复性和线性范围,确定正常生育男性的参考值。并对122例不育门诊男性的精子DFI、轻度DNA损伤(DFIm)和重度DNA损伤(DFIs)与精子浓度及活力的相关性进行分析。结果:利用十字象限门建立的流式细胞术,可以很明显地区分不同人群的精子DFI、DFIm和DFIs。高、中、低DFI的精液样本使用流式细胞术重复检测10次,所得CV均低于5%。精子DFI在8.93%~53.90%范围内有极好的相关性,相关系数r>0.99。基于274例正常生育男性的精子DFI结果,以95%上限确定正常参考值范围,正常生育男性精子DFI≤25.50%。精子DFI与精子浓度没有显著相关性,但与精子活动率和前向运动精子百分率呈显著负相关,且DFIs与精子活动率和前向运动精子百分率的相关性(r分别为-0.592和-0.543)明显高于DFIm(r分别为-0.323和-0.236)。精子活动率和前向运动精子百分率降低组的精子DFIs和DFIm均显著高于正常组,且两组DFIs的差异(P<0.01)显著高于DFIm(P<0.05)。结论:本研究建立的可反映精子DNA损伤严重程度的流式细胞术,相比于现有的存在一定缺陷的流式细胞术,更适合在临床常规工作中推广使用。重度精子DNA损伤指标DFIs可能与生殖的关系更为密切。

小儿肺炎支原体的流行病学调查及感染后血常规变化的临床分析

肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia,MP）是引起小儿呼吸道感染的常见病原体之一,主要通过呼吸道传播,已成为小儿肺炎的常见病原菌。近年来,随着人们健康意识的提高及检测技术的日趋完善,小儿MP感染率报道有增加趋势;MP感染后,除可引起呼吸系统症状外,

重组人中性粒细胞弹性蛋白酶的制备及鉴定

目的:利用基因工程技术制备纯化的重组人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE),为进一步制备HNE的相应抗体和建立精液HNE的检测方法奠定基础。方法:利用HNE的特异引物从人外周血粒细胞中获得HNEmRNA,并将其cDNA克隆入质粒pGEX-2T中以获得重组质粒pGEX-2T/HNE。重组质粒经PCR、双酶切和基因测序鉴定后转入感受态大肠埃希菌DH5α中,并用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白GST/HNE。重组融合蛋白经凝血酶裂解后获得重组HNE,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化后获得纯化的重组HNE。结果:成功制备重组表达质粒pGEX-2T/HNE,并转化入大肠埃希菌DH5α中。经IPTG在18℃过夜诱导后成功获得重组融合蛋白GST/HNE的表达。经凝血酶裂解和谷胱甘肽琼脂糖珠纯化后成功获得纯化的重组蛋白HNE。结论:纯化的重组HNE的获得为进一步制备HNE的相应抗体和建立精液HNE的检测方法奠定了基础。

流式细胞术检测精子DNA损伤的标准化与质量控制初步研究

目的:对流式细胞术检测精子DNA损伤的标准化和质量控制进行初步研究。方法:随机选取精液样本,观察酸变性时间,吖啶橙(AO)染色时间,精液样本冷藏、冷冻及反复冻融对精子DNA碎片指数(DFI)结果的影响。结果:随着酸变性时间延长,精子DFI逐渐增高,与酸变性30 s相比,酸变性至2 min时DFI即显著增加(P<0.05)。AO染色5、20、40、60、100、140 min后的精子DFI结果没有显著差异。精液样本于2~8℃冷藏后,精子DFI随冷藏时间延长显著增加,冷藏2 d后精子DFI即明显增加。精液样本可以直接于-20℃冷冻保存,且反复冻融3次对精子DFI结果影响不大,但DFI检测结果不够稳定。精液样本分装后冷冻,间隔1 d检测1次,共1个月,以此数据模拟室内质控,所得CV值为7.13%。结论:DFI检测中,确保酸变性时间的准确非常重要,最长不能超过1 min。染色时间或染色后放置时间对精子DFI结果没有显著影响。精子DFI检测最好为新鲜精液样本,如需冷藏,不能超过1 d。直接冷冻精液样本可以作为精子DFI检测的室内质控品。冷冻保护剂能否使冷冻精液样本更为稳定、室间质控品如何制备和运输将是未来要解决的关键问题。

全自动精浆锌检测方法的建立及评价

目的建立全自动精浆锌检测方法并对其准确性、重复性和线性范围等进行评价。方法利用终点法检测精浆锌浓度，并在全自动生化分析仪上建立检测参数，并评估该方法的试剂空白吸光度、准确性、重复性和线性范围，同时与目前临床上常用的化学比色法精浆锌检测试剂盒进行比较。结果试剂空白吸光度平均为0．028。3份高、中、低锌浓度的精浆样本重复测定10次，其CV值分别为0．67％、2．04％和4．18％。采用回收率分析来评价准确性，回收率范围为95．68％～103．81％。精浆锌浓度在0．2～7mmol／L范围时，具有良好的线性关系（r^2=O．9944）。以精浆锌检测试剂盒（化学比色法）作为对照试剂，全自动检测法作为试验试剂，两者对115例精浆样本的检测结果没有显著性差异[（2．51±1．26）mmol／Lvs（2．54±1．17）mmol／L，t=-1．589，P=-O．115]，且呈显著正相关（，=0．9686，P〈O．01）。结论本研究建立的全自动精浆锌检测法有较低的试剂空白，重复性和准确性较好，且与目前临床上使用的化学比色法有很好的一致性。该法操作简单、快速，精浆样本无需稀释，适合临床上大批量样本的检测筛查，大大节省了人力和试剂成本。