microRNA-24通过下调Cdk4和CyclinD3抑制胰岛β细胞增殖

目的 :通过共同过表达Cdk4、CyclinD3与microRNA-24,观察miR-24所引起的胰岛β细胞增殖抑制是否得到逆转,从而判定Cdk4、CyclinD3是否介导了这种抑制作用。方法:在胰岛β细胞系MIN6细胞中过表达miR-24,运用WST-1法检测细胞活力,借助于流式细胞术检测细胞周期,Hoechst33342染色和Brd U标记检测细胞增殖凋亡情况。Western blot检测Cdk4、CyclinD3蛋白水平。构建cyclinD3-p CMV5-myc,cdk4-p CMV5-myc重组质粒,与pre-miR-24、pre-Neg miRNA precursors共转染MIN6细胞,Brd U标记检测细胞增殖。结果:过表达miR-24引起MIN6细胞活力降低,细胞周期G2期阻滞,细胞增殖受到抑制而并没有显著的凋亡;过表达miR-24降低了Cdk4、CyclinD3蛋白水平;而Cdk4、CyclinD3的过表达逆转了miR-24引起的胰岛β细胞增殖抑制。结论:miR-24通过降低Cdk4、CyclinD3蛋白水平抑制胰岛β细胞增殖,该作用可被Cdk4、CyclinD3蛋白的过表达逆转。

3T3-L1前脂肪细胞分化过程中自噬的发生与线粒体数目的改变

目的 :探索3T3-L1前脂肪细胞分化过程中自噬的发生与线粒体数目改变的关系。方法 :培养3T3-L1前脂肪细胞,利用电子显微镜技术观察细胞分化过程中自噬小泡的形成与变化、线粒体数目的改变,同时运用Western blot检测NRF1、mt TFA的表达。结果:电镜结果显示:在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,自噬小泡出现在细胞分化的第2天,随后迅速增加,第4天自噬小泡的面积达到最大,第6天开始消失;线粒体数目在分化第2天显著下降,第4天开始逐渐增加,到第6天超过分化前的水平并在第8天恢复;在分化过程中的自噬小泡内,有被吞噬的线粒体。Western blot结果则显示调控线粒体合成的转录因子NRF1、mt TFA的表达在分化第2天显著下降,第4天迅速升高,至分化末期再次下降。结论 :3T3-L1前脂肪细胞分化过程的早中期形成了大量的自噬小泡,包括一些线粒体自噬,这些线粒体自噬的发生可能是分化早期线粒体数目减少的原因之一。

香菇多糖抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡的作用及机制

目的探讨香菇多糖（lentinan，LNT）对链脲佐菌素（streptozoein，STZ）诱导的大鼠胰岛素瘤细胞系（INS-1）细胞凋亡的影响，并探索其可能的作用机制。方法四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法观察STZ单独处理、STZ和不同浓度LNT共同处理INS-1细胞24h后细胞活力的改变：AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡；Hoechst33258染色和末端转移酶介导的dUTP切口末端标记（TUNEL）法验证STZ和LNT的处理对INS-1细胞凋亡的影响；放免法检测经药物处理后INS-1细胞贮存、分泌胰岛素的功能；Western印迹分析经STZ、LNT处理后INS-1细胞相关信号通路蛋白PDX-1、Bcl-2（抗凋亡基因）、Bax和Cleavedeaspase-3（促凋亡基因）的表达差异。结果与空白组相比，LNT能浓度依赖性地抑制STZ引起的INS-1细胞活力下降，浓度为200μg／ml时开始有统计学差异（P〈0．05）；LNT能抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡；LNT可抑制STZ诱导的INS-1细胞贮存、分泌胰岛素功能受损和PDX-1蛋白表达量下降；LNT能影响细胞凋亡信号通路相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase．3表达水平。结论香菇多糖能抑制STZ诱导的INS-1细胞凋亡，可能是通过影响凋亡信号通路中相关蛋白分子的水平实现的。