趋化因子CCL28基因的克隆表达及其多抗制备

将原核表达质粒pGEX-6P-1-CCL28转化至大肠埃希菌BL21中,经IPTG诱导,获得了GST-CCL28可溶性融合表达产物。利用纯化的GST-CCL28蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗GST-CCL28的多克隆抗体。同时将CCL28基因亚克隆进真核表达载体,经测序验证后命名为pcDNA3.1-CCL28。间接免疫荧光及Western blot试验结果进一步证明,所获得的抗GST-CCL28多克隆抗体能特异性的识别转染pcDNA3.1-CCL28质粒的DF-1细胞内高表达的CCL28蛋白。这一研究为制备抗CCL28单克隆抗体和探究与CCL28相关的生物学功能及其机制奠定了良好的基础。

乏氧诱导的A549细胞外泌体特征及其对放射抗拒性的影响

目的 收集乏氧和常氧条件下人肺腺癌A549细胞产生的外泌体，观察常氧下A549细胞与外泌体共培养后对X射线敏感性及侵袭性的变化。方法 分别在乏氧（1% O2）和常氧条件下（21% O2）培养A549细胞，超高速离心法收集在细胞分泌的常氧外泌体（N-EXO）和乏氧外泌体（H-EXO）。NanoSight检测外泌体数量，扫描电镜观察外泌体的外观和大小。蛋白印迹检测外泌体蛋白CD63。CCK8检测细胞对X射线的耐受性。荧光显微镜观察A549细胞对PKH67标记的外泌体的摄取。细胞划痕实验和Transwell实验观察加入不同的外泌体后细胞侵袭和侵袭性变化，ELISA方法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9）的表达变化。细胞克隆形成实验观察二种外泌体对细胞放射抵抗性的改变。结果 每ml细胞培养液中H-EXO的数量增多。H-EXO和N-EXO均呈现出典型的环饼状，H-EXO直径变小，粒径分布在30~200 nm，小于N-EXO的粒径（50~220 nm）。H-EXO和N-EXO的CD63表达无明显差别。乏氧条件培养的A549细胞接受2 Gy X射线后，细胞的增殖水平在4和6 d时远高于常氧条件下的细胞。PKH67绿色荧光标记的外泌体分布在细胞内部。12、24、48 h后，H-EXO组细胞划痕宽度远小于N-EXO组（t=2.96、6.76、3.35，P〈0.05）。H-EXO组细胞穿膜细数量大于N-EXO组和对照组（t=4.84、7.88，P〈0.01）。H-EXO组上清液中MMP2（t=4.70、3.21，P〈0.05）和MMP9（t=5.61、3.76，P〈0.05）表达水平较对照组和N-EXO组均明显增高。对照组、N-EXO和H-EXO的D0值分别为2.614、2.552、4.850。H-EXO较N-EXO可以明显增强A549细胞的放射抵抗性。结论 乏氧条件下，A549细胞释放的外泌体数量增多、粒径变小，乏氧外泌体可以促进常氧细胞的侵袭性，并且能够增强细胞对X射线的耐受性。

新型纳米金材料的合成及其对HepG2细胞放射增敏的影响

目的 合成新型纳米金复合物GAL-PEG-GNPs，探讨其体外放射增敏效应及增敏机制。方法 制备GAL-PEG-GNPs并进行表征。将HepG2细胞分为对照组、GNPs组和GAL-PEG-GNPs组。CCK-8法检测GAL-PEG-GNPs的细胞毒性，并计算IC50值；TEM和ICP-MS检测细胞对2种纳米材料的摄取；克隆形成实验检测放射增敏水平；流式细胞术分析细胞周期的变化；免疫蛋白印迹分析细胞凋亡相关蛋白变化；酶标仪检测细胞内过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、总还原型谷胱甘肽（GSH）的表达水平。结果 GNPs和GAL-PEG-GNPs溶液的紫外可见吸收峰分别位于520和530 nm，GNPs和GAL-PEG-GNPs的直径分别为（22.6±2.12）和（32.0±1.41）nm。GAL-PEG-GNPs的细胞毒性与GNPs类似（P〉0.05），IC50值分别为5.001和4.997 μg/ml。GAL-PEG-GNPs被HepG2细胞的摄取量高于GNPs。GNPs和GAL-PEG-GNPs的放射增敏比（SER）分别为1.46和1.95。细胞经过处理后，处于G2/M期的比例明显提高（t=14.20，P〈0.05）。GNPs组和GAL-PEG-GNPs组Cytochrome C、Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达水平较对照组明显提高，而Bcl-2的表达呈现降低趋势。GAL-PEG-GNPs组CAT、SOD、总GSH较对照组均明显减少（t=12.34、29.39、12.85，P〈0.05）。结论 GAL-PEG-GNPs对HepG2细胞具有较好的放射增敏效应，增敏机制可能与GNPs诱导大量自由基产生，进而启动凋亡基因程序有关。

功能化纳米基底分离循环肿瘤细胞方法的建立

本研究旨在通过纳米基底联合适配体的方法建立一种高效、快速分离循环肿瘤细胞(CTCs)的新技术。通过反应离子刻蚀(RIE)法在玻片表面建立纳米结构,使用氧化物蚀刻机处理3~15 min。抗上皮细胞黏附分子(EpCAM)适配体(AEA)及对照DNA采用滚环复制方法合成。将荧光标记的AEA和对照DNA分别与人前列腺癌PC3、Ramos细胞孵育。将适配体溶液加到各个玻璃基底上过夜孵育建立功能化的纳米基底。对肿瘤细胞的捕获,并用2 ml掺入PC3前列腺癌细胞的健康人外周血标本模拟实验,应用耦联AEA的功能化纳米基底捕获肿瘤细胞。