衣原体pORF5质粒编码蛋白致病机制的研究进展

衣原体(Chlamydia)是一类具有独特的两相发育周期、专性细胞内寄生的革兰阴性菌,能引起人类多种疾病。pORF5是衣原体隐蔽性质粒编码的分泌性效应蛋白。近年来研究证实,pORF5质粒编码蛋白是衣原体重要的毒力蛋白,与衣原体致病密切相关。现就衣原体pORF5质粒编码蛋白的生物学特性、致炎性作用、抗凋亡作用及促自噬作用作一概述。

网络新媒体交流模式下的基础医学硕士研究生科研能力培养

基础医学硕士研究生是我国医学科学研究团队的生力军和后备力量。如何顺应新时代基础医学的发展需求,改进改良高等院校传统的医学硕士研究生培养模式、方法及手段,进一步加强基础医学硕士研究生科研能力的培养,一直是21世纪中国高等基础医学教育领域关注和改革的重点及难点。随着网络新媒体技术的迅速发展,将研究生课程学习设置到复杂的、有意义的科学问题情景之中的PBL教学模式,结合流媒体、云储存技术以及微信/QQ等网络新媒体技术,将更符合基础医学硕士研究生的新时代科研思维培养规律,在提高研究生科研思维、独立创新能力以及自主学习能力等科研能力培养方面凸显优势。

肺炎支原体荚膜多糖抑制树突状细胞吞噬和膜分子表达

目的:了解肺炎支原体(Mp)荚膜多糖(CPS)通过结合树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(DC-SIGN)对树突状细胞吞噬功能及细胞表面膜分子表达的影响。方法:复苏培养Mp菌株,抽提和纯化CPS。培养人外周血单个核细胞来源的DC,吉姆萨染色观察和流式细胞术(FCM)鉴定;用CPS刺激DC,FCM检测DC对FITC-多聚糖的吞噬指数、DC表面特异标志CD83、HLA-DR抗原以及协同刺激分子CD80和CD86的表达。结果:培养7 d的DC有典型的树突状结构,并高表达CD11c分子。经CPS刺激后,DC内FITC-多聚糖的平均荧光强度较对照PBS处理组显著增加(P<0.05),DC表面膜分子CD83、HLA-DR、CD80和CD86较对照组显著减少(P<0.05)。用CPS刺激被DC-SING受体封闭的DC,发现DC内FITC-多聚糖吞噬指数和四种膜表面分子的表达与对照组差异均无显著性(P>0.05)。结论:Mp CPS可促进DC的吞噬功能和减少细胞膜分子CD83、HLA-DR、CD80和CD86的表达。

从T7噬菌体展示cDNA文库筛选生殖支原体黏附蛋白的互作蛋白

目的:从人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示cDNA文库筛选生殖支原体黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。方法:以原核表达、纯化的重组生殖支原体黏附蛋白(r Mg Pa)为靶分子,对人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库进行4轮生物淘选,采用T7特异性引物扩增阳性克隆的插入片段,PCR产物测序后进行BLAST分析,间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot检测阳性噬菌体与rMgPa的特异结合。结果:经过4轮生物淘选,噬菌体克隆富集明显;DNA测序后经BLAST比对分析,结果表明随机挑取的32个阳性克隆包括7种不同序列,其中以RPL35重复次数最多;间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot结果表明7个代表性噬菌体均能与rMgPa特异结合。结论:60S核糖体蛋白L35(RPL35)可能是MgPa的互作蛋白,为深入了解MgPa的生物学功能以及生殖支原体的致病机制奠定了实验基础。

利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白

从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa;将诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内,检测其毒性和自激活活性;将人尿道上皮细胞cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng转入到含pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的酵母菌株中,筛选阳性克隆。检测阳性克隆LacZ报告基因的活性。提取阳性克隆质粒进行DNA测序与BLAST分析。结果显示,成功构建的诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa两者都没有自激活功能,且pBT3SUC-MgPa的活性强于pBT3STE-MgPa。用pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞。经DNA测序与BLAST分析结果表明筛选到的28个阳性克隆归属于23个不同的蛋白。从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到23个与MgPa相互作用的蛋白,为阐明MgPa的功能及Mg可能的致病机制提供参考。

重组梅毒螺旋体诊断抗原的研究进展

梅毒是一种多阶段发展的性传播疾病,临床表现复杂,实验室诊断主要依赖血清学方法。近十余年来,基于重组梅毒螺旋体(Tp)诊断抗原的血清学方法大力促进了梅毒特异性实验室诊断的快速发展。但目前所采用的重组抗原对诊断早/晚期梅毒,或区分不同感染阶段,或疗效判断仍然存在不足。本文综述重组Tp脂蛋白及新型候选抗原(包括膜表面暴露蛋白、黏附蛋白、周质间隙蛋白和鞭毛蛋白等)在梅毒诊断中的应用价值及局限性,并概括了最佳候选Tp诊断抗原组的条件,为进一步研究其他Tp诊断抗原提供参考。

单增李斯特菌质粒研究进展

单增李斯特菌是一种可引起李斯特菌病的重要食源性病原体,质粒在单增李斯特菌中分布广泛,这些质粒对宿主的环境适应能力、毒力以及耐药有一定的促进作用。基因组测序技术的发展为质粒的发现及功能研究提供了很好的基础。本文综述了单增李斯特菌质粒的分类、分布及其生物学功能研究进展。

死亡结构域蛋白Daxx与DNA病毒蛋白相互作用及影响的研究进展

死亡结构域蛋白Daxx是一种多功能蛋白,能参与细胞凋亡、抗病毒等活动。病毒感染发生时,病毒生成的某些蛋白与Daxx相互作用,经不同途径可抑制或促进Daxx的抗病毒反应。Daxx与不同病毒蛋白或甚至同一病毒的不同蛋白相互作用,都将产生不同的抑制或促进作用。现对Daxx与人腺病毒、人巨细胞病毒和人乳头瘤病毒等DNA病毒表达蛋白的相互作用及影响作一简要概述。

解脲支原体Ferritin基因的原核表达及抗氧化功能研究

目的构建解脲支原体Ferritin蛋白的原核表达载体,纯化重组Ferritin蛋白并测定其抗氧化功能,为解析解脲支原体的抗氧化机制奠定基础。方法利用荧光定量PCR检测氧化胁迫下Ferritin基因的相对表达量。根据Ferritin基因序列,设计引物,PCR扩增Ferritin全长片段。将解脲支原体Ferritin基因中编码色氨酸的密码子TGA突变为TGG,将突变后的Ferritin基因连接到原核表达载pET28a得到重组质粒pET28a-Ferritin,转化大肠埃希菌BL21(DE3)得到重组菌BL/pET28a-Ferritin,IPTG诱导Ferritin蛋白表达并用镍柱亲和层析进行纯化。体外试验测定Ferritin蛋白的Fe2+结合特性,亚铁氧化酶活性和抗氧化能力。结果 Ferritin基因在H2O2或者CHP胁迫表达上调。成功构建能够表达全长Ferritin蛋白的重组质粒pET28a-Ferritin。诱导并纯化得到理论分子质量单位为22ku的重组Ferritin蛋白。结合Fe2+后,Ferritin蛋白的内源荧光值降低。Ferritin具有Fe2+氧化酶活性,能催化Fe2+生成Fe3+,并能够减少氧自由基的产生。结论解脲支原体Ferritin基因在氧化胁迫条件下表达上调,其表达产物具有亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。

抗ATRX-C_(2193-2492)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备X连锁的α地中海贫血/精神发育迟滞综合症(ATRX)蛋白C端的多克隆抗体,分析ATRX蛋白在宫颈组织中的表达和定位。方法将纯化后的6His-ATRX-C_(2193-2492)蛋白免疫BALB/c小鼠,获得抗血清;饱和硫酸铵盐析沉淀法以及亲和层析法纯化抗血清,制备抗ATRX-C_(2193-2492)多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价;并用Western blot法鉴定其特异性;利用免疫组织化学技术检测宫颈癌组织细胞中ATRX的表达与定位。结果制备的ATRX-C_(2193-2492)抗血清效价可达1∶12 800,该抗体能特异性识别ATRX-C_(2193-2492)蛋白;并检测出在宫颈癌癌旁组织中ATRX具有较高表达并主要定位在细胞核,而在宫颈癌组织细胞中虽仍主要表达于细胞核,但表达量明显减少。结论成功制备了抗ATRX-C_(2193-2492)多克隆抗体,能够应用于宫颈组织中的ATRX蛋白表达的检测。

一种新纳米乳作为流感疫苗佐剂的效果

目的筛选有佐剂效果的纳米乳新配方,并从稳定性、粒径大小、载水范围、佐剂效果与安全性等方面评价其作为疫苗佐剂的可行性。方法依据伪三元相图筛选出能被水大量稀释的配方,测定基本性质如p H,黏度,粒径,长期保存或离心条件下是否保持稳定等。将其做为佐剂与流感疫苗混合进行动物实验。25只ICR小鼠随机分为生理盐水组、单独疫苗组、铝佐剂对照组、弗氏佐剂组和纳米乳佐剂组,每组5只,经大腿腓肠肌注射流感H3N2裂解疫苗。第三周加强免疫一次,初次免疫后一周内观察各组小鼠的体重变化,每周收集血清以检测血凝抑制抗体的效价,用SPSS18.5软件分析比较各组小鼠产生的抗体水平。最大给药量实验评价其安全性。结果该纳米乳理化性质稳定,p H值为7.5,黏度与水接近,平均粒径为56.3 nm,离心及长期保存不破乳。纳米乳佐剂组小鼠能产生更高水平的血凝抑制抗体,在0.25 mg/10 g给药量下无小鼠死亡。结论该纳米乳配方作为流感疫苗佐剂具有良好的稳定性、安全性及佐剂效果。

RIPK1/RIPK3依赖的细胞程序性坏死在清除兼性胞内菌感染中的作用

程序性坏死是一种与炎症相关的细胞死亡模式,与依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶调控的凋亡不同,这种细胞死亡模式受受体互作蛋白激酶(RIPK)1和3调控。在兼性胞内菌感染过程中,宿主会运用多种策略使隐藏在细胞内的兼性胞内菌重新暴露于抗菌机制面前。许多研究报道表明宿主细胞的程序性坏死是其中一种重要的策略,有助于兼性胞内菌感染的清除。在本文中,我们将探讨在宿主细胞内发生的由RIPK1/RIPK3途径介导的程序性坏死机制,以及其在清除兼性胞内菌感染中的意义。

肺炎克雷伯菌HdeA蛋白的抗酸理化性质鉴定

肺炎克雷伯菌是一种常见的院内条件致病菌,通常定植在人体的呼吸道和胃肠道。但肺炎克雷伯菌是怎样在胃液的强酸条件下存活并进入肠道尚不十分清楚。本研究发现,酸性条件能够诱导肺炎克雷伯菌Kp Hde A基因表达上调。克隆Kp Hde A基因并将其转化大肠杆菌,获得可溶性的Kp Hde A蛋白并利用镍离子亲和层析纯化得到目的蛋白。光散射分析证明,酸性胁迫下,Kp Hde A蛋白能够减少酸诱导的醇脱氢酶聚集。荧光实验证明,酸胁迫可以诱导Kp Hde A蛋白的疏水基团暴露。圆二色谱实验证明,酸性条件能够诱导Kp Hde A蛋白形成无序结构。此外Kp Hde A蛋白的表达能提高大肠杆菌的耐酸能力。故推测,Kp Hde A蛋白具有分子伴侣活性,并在肺炎克雷伯菌抵抗酸胁迫中起重要作用。

Daxx对γ射线诱导HeLa细胞凋亡的影响

研究过表达死亡结构域相关蛋白(Daxx)对经γ射线照射过的细胞凋亡的影响,探讨Daxx与辐射诱导细胞凋亡之间的关系及其机制。通过转染将宫颈癌HeLa细胞分为正常对照组、空质粒转染阴性组与Daxx转染组,利用生物细胞辐照仪经γ射线照射至不同剂量;Western blot检测细胞中Daxx的表达;MTT检测细胞的增殖情况;ELISA检测细胞中Caspase-8的相对活性;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果发现:随着照射剂量增加,细胞数量逐渐减少,且其中变形细胞越来越多;Daxx表达水平随着照射剂量增加而升高;Daxx转染的辐照细胞组的细胞增殖抑制率、A 405值以及细胞凋亡率均明显高于未辐照细胞组,差异均有统计学意义(p<0.01,p<0.05,p<0.05)。过表达Daxx能通过上调经γ射线照射细胞的Caspase-8活性,促进辐射诱导的细胞凋亡。

Wnt/β- catenin信号通路在细菌致病中的作用

Wnt/β-catenin信号通路是一条高度保守的细胞内信号转导通路,具有介导细胞黏附、调控增殖、凋亡、参与炎症反应等多种生物学功能,在多种细菌的感染和致病过程中发挥重要作用。研究Wnt/β-catenin信号通路激活的分子机制及其在疾病发生、发展中的作用,不但可以了解细菌的致病机制,还为其治疗提供了新的靶点和策略。现将该信号通路在衣原体、结核分枝杆菌、铜绿假单胞菌和幽门螺杆菌致病中的作用作一概述。

沙眼衣原体LpxA基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)LpxA基因并分析其生物学特性。[方法]根据Ct LpxA基因序列设计特异性引物,利用PCR扩增LpxA基因,并把LpxA基因连接到p MD18-T载体,挑取阳性克隆进行PCR和DNA测序验证。最后使用生物信息学软件分析LpxA蛋白的生物学性质。[结果]从Ct基因组中PCR扩增得到840 bp的Ct LpxA基因,该基因共编码280个氨基酸。LpxA蛋白无信号肽,定位在细菌细胞质。二级结构预测得知α-螺旋占19.6%,延伸链占32.8%,β-转角为11.4%,无规卷曲为36%。三级结构预测得知3个相同的LpxA分子组成同源三聚体。预测得知LpxA蛋白有11个B细胞表位。[结论]克隆得到Ct LpxA基因,并预测了其结构和功能。

利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库

利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1) cDNA文库。Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5'接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体p PR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性。本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础。

穿透支原体铁蛋白的原核表达、纯化及生物信息学分析

[目的]表达纯化穿透支原体(Mycoplasma penetrans)铁蛋白(Ferritin)并利用生物信息学方法分析该蛋白的生物学特性。[方法]从NCBI网站上查到Mpe Ferritin的DNA和蛋白序列,并合成Ferritin基因,设计PCR引物,以合成基因为模板扩增Ferritin片段,将其与pET15b载体连接,将连接产物转化到大肠杆菌Top10感受态细胞。挑取阳性菌落,利用PCR和测序验证,提取质粒pET15b-Ferritin并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达,并使用Ni2+亲和法纯化Ferritin蛋白。然后用生物信息学方法分析Ferritin蛋白的生物学特性。[结果]Mpe Ferritin基因全长为540 bp,编码180个氨基酸。成功构建重组质粒pET15b-Ferritin,表达并纯化得到Ferritin蛋白。Ferritin蛋白定位于细胞质,无信号肽。它的α-螺旋占71.5%,β-转角占6.7%,延伸链占5.0%,无规卷曲占16.8%。由24个同源Ferritin蛋白分子组成24聚体。[结论]通过基因工程方法纯化得到Ferritin蛋白并分析了Ferritin的生物学性质。

梅毒螺旋体黏附蛋白生物信息学分析

目的 对梅毒螺旋体(Tp)7种黏附蛋白作更进一步的生物信息学分析,为其在Tp致病过程中的机制研究提供理论依据。方法 通过使用NCBI、BLAST、CDD、BioEdit、ExPASy、SignalP、TMHMM、NetMHC II pan 3.2等生物信息学分析方法,分析7种黏附蛋白的一般性质、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点及抗原表位等。结果 分析预测了Tp中7种黏附蛋白一般性质,7种黏附蛋白皆为亲水性蛋白,除Tp0155、Tp0750外,均具有跨膜结构域,除Tp0483外,均含有信号肽,除Tp0435和Tp0483外,其余蛋白均具有糖基化位点,7种黏附蛋白均含多个磷酸化位点以及B细胞、T细胞表位。结论 7种黏附蛋白在Tp入侵宿主时,极有可能降解宿主细胞外基质中的成分继而穿透基底膜并且损伤宿主细胞,从而有利于Tp在宿主体内的侵袭和播散。

肺炎支原体铁吸收调节蛋白基因的克隆表达与纯化

[目的]克隆肺炎支原体铁吸收调节蛋白(Fur)基因并纯化Fur蛋白,为研究其生物学功能奠定基础。[方法]利用Clustal Omega分析肺炎支原体Fur蛋白及其同源序列并用MEGA6.0构建进化树,通过PCR扩增Fur基因并对其进行双酶切,然后连接到p ET28a,得到重组载体p ET28a-Fur,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导Fur蛋白表达,并通过亲和层析纯化Fur蛋白。[结果]多序列比对和进化树分析表明Mp含有一个Fur蛋白。克隆得到大小为477 bp的Fur基因,编码159个氨基酸。得到重组表达质粒p ET28a-Fur,该质粒能在大肠杆菌中能高效表达,并纯化得到重组Fur蛋白。[结论]成功克隆获得Mp Fur基因,在大肠杆菌中高效表达并获得高纯度Fur蛋白。