耐多药结核分枝杆菌对喹诺酮类药物的耐药性与gyr基因突变的初步研究

目的分析耐多药结核分枝杆菌(Multiple drug-resistant tuberculosis,MDR-TB)临床分离株的gyr基因突变特点,探讨MDR-TB对喹诺酮类药物耐药产生与gyr基因突变的关系。方法采用比例法对耐多药结核临床分离菌株进行氧氟沙星的药物敏感性检测,应用DNA直接测序法检测MDR-TB的gyr基因突变情况。结果 125株MDR-TB临床分离株中,50株对喹诺酮类耐药,耐药率为40%。50株耐药菌株中,40株gyr基因发生突变:其中39株gyrA基因突变,突变率为78%,突变位点包括90,91和94位氨基酸;5株gyrB基因突变,其中4株合并gyrA基因突变,gyrB基因突变位点为500,506,534和539位氨基酸。结论 MDR-TB中的喹诺酮类药物耐药态势比较严峻,其对喹诺酮类药物耐药机制主要与gyrA基因突变有关。

肺炎嗜衣原体Cpn0810重组蛋白诱导THP-1细胞产生促炎因子和凋亡的研究

目的:在E.coliBL21中表达肺炎嗜衣原体Cpn0810,并研究该蛋白能否诱导人单核细胞(THP-1)产生TNF-α和IL-6等促炎因子和细胞凋亡。方法:PCR扩增Cpn0810蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0810重组质粒,在E.coliBL21中诱导表达,经ToxinEraser纯化柱纯化后,用不同浓度的GST-Cpn0810作用THP-1细胞,ELISA法检测TNF-α和IL-6的水平,Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况。结果:构建了重组质粒pGEX6p-2/Cpn0810,并在E.coliBL21菌中高效表达。该蛋白能诱导THP-1细胞以时间、剂量依赖方式表达TNF-α和IL-6;当10mg/L GST-Cpn0810处理THP-1细胞24 h后,形态学上,细胞表现为皱缩、核碎裂、细胞起泡及凋亡小体等凋亡特征。结论:表达并纯化的Cpn0810蛋白能诱导THP-1细胞分泌TNF-α和IL-6等促炎因子和诱导其发生凋亡。

MGIT 960和比例法对结核分枝杆菌药物敏感性试验的对比研究

目的评价BACTEC MGIT960检测8种抗结核药物耐药性的效果。方法用MGIT960对结核杆分枝杆菌临床分离菌株进行抗结核药物异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星和乙硫异烟胺的药敏检测,并将结果与L-J比例法结果进行比较分析。结果用MGIT960法与L-J比例法对118株结核分枝杆菌临床分离株进行异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、卡那霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺的耐药性检测,两种方法的符合率分别为97.5%(115/118)、92.4%(109/118)、96.6%(114/118)、84.7%(100/118)、94.9%(112/118)、94.1%(111/118)、97.5%(115/118)、85.6%(101/118)。MGIT960完成一线/二线药物药敏试验的时间平均为8.9和8.3天,L-J法则分别为26.7天和26.1天,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 MGIT960所得的药敏结果与传统比例法有较高的一致性,但检测时间较短,有利于耐药结核病人的早期诊断和治疗。

问号状钩端螺旋体外膜蛋白Loa22的克隆、表达及对豚鼠的免疫保护作用研究

目的构建问号状钩体强毒赖型56601株外膜蛋白Loa22的重组质粒,表达Loa22蛋白,研究该蛋白对豚鼠的保护作用。方法以问号状赖型钩体56601株基因组为模板扩增目的基因,将Loa22基因克隆至原核表达载体PQE-31,构建PQE31-Loa22重组体,将其转入大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。于0、2、4周将蛋白及对照PBS分别经豚鼠腹股沟、腋下免疫豚鼠。每次剂量为蛋白50μg/只,末次免疫后2周,用培养3d的56601株钩体从腹腔攻击各免疫组豚鼠(1ml/只)。连续观察15d,观察各免疫组豚鼠发病情况,并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片。分析蛋白Loa22对豚鼠的免疫保护作用。结果成功扩增出Loa22基因,构建原核重组质粒PQE31-Loa22。重组质粒能在大肠杆菌M15中高效表达Loa22蛋白。用Loa22蛋白主动免疫的豚鼠用56601株钩体攻击,结果显示无发病现象,而免疫对照组的豚鼠中出现了食欲不振、活动减少等现象,病理切片有明显改变。结论成功构建了Loa22重组原核表达质粒,表达纯化的蛋白可以使豚鼠抵抗同型钩体的攻击,免疫保护作用为82%。

等位基因特异性多重PCR快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的初步研究

目的建立等位基因特异性多重聚合酶链反应(multiplex allele-specific PCR,MAS-PCR)技术,以快速检测结核分枝杆菌对喹诺酮的耐药性。方法根据结核分枝杆菌gyrA基因序列,分别设计4条特异性寡聚核苷酸引物,优化PCR条件,建立针对gyrA基因90和94位点突变进行检测的MAS-PCR技术,对临床分离菌株进行喹诺酮耐药性检测,同时以比例法和DNA直接测序法做对照。结果共对144株喹诺酮敏感株和56株喹诺酮耐药株进行了MAS-PCR检测。MAS-PCR与比例法比较,敏感性为53.57%(30/56);与DNA测序比较,敏感性为71.43%(30/42),特异性均为100%(144/144)。结论 MAS-PCR技术检测结核分枝杆菌对喹诺酮耐药性简便、快速、特异性高,但敏感性需进一步提高。

利用分枝杆菌的重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌的方法研究

目的利用pJV53质粒编码的分枝杆菌重组工程系统将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组。方法将pJV53质粒转入耻垢分枝杆菌,使其表达重组蛋白,制备带有重组蛋白的感受态细胞;从质粒pBS1479中扩增出tap片段,从质粒pSMT3中扩增hyg片段,从耻垢分枝杆菌基因组中分别扩增出aasf基因及其5′端非编码区片段AASF5和aasf基因下游3′端非编码区片段AASF3,利用重叠PCR将以上4个片段拼接在一起,形成最终的敲入片段A5THA3;将构建好的敲入片段转入感受态细胞,使其重组入耻垢分枝杆菌基因组中,PCR和DNA测序鉴定敲入效果。结果重叠PCR技术得到全长为3 200 bp的敲入片段,PCR与DNA测序结果证实带有TAP标签的A5THA3片段已成功敲入耻垢分枝杆菌基因组中。结论成功将TAP标签敲入耻垢分枝杆菌基因组,为下一步进行目的基因功能研究奠定了基础。

肺炎嗜衣原体Cpn0425重组蛋白的克隆与表达及抗原性研究

目的构建重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,在E.coli BL21中进行诱导表达,纯化获得重组融合蛋白Cpn0425,并评价其抗原性。方法 PCR扩增肺炎嗜衣原体Cpn0425蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0425重组质粒,测序正确后在E.coli BL21中诱导表达,用SDS-PAGE和Western-Blot进行分析和鉴定。结果构建了重组质粒pGEX6p-2/Cpn0425,并在E.coli BL21菌中高效表达出Mr约为50kDa的GST-Cpn0425目的蛋白,超声裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌体细胞内以可溶性形式表达,经采用默克Novagen的GST纯化树脂纯化获得纯度在95%以上的重组蛋白。结论获得了Cpn0425基因片段,并在E.coli BL21中成功表达,GST-Cpn0425具有良好的抗原性。

D-半乳糖胺/脂多糖诱导急性肝衰竭机制的研究进展

急性肝衰竭（acuteliver failure，ALF）是由多种原因引起的大量肝细胞坏死及（或）严重的肝功能障碍，病人短期内进展至肝性脑病的一种综合征。临床死亡率较高，尚缺乏特异性的治疗措施。目前国内外学者多应用D一半乳糖胺（D—galactosamine，D—GalN）造成原发性肝损伤，

人乳头瘤病毒E2蛋白对细胞增殖作用的研究进展

宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关。HPV E2蛋白能特异性抑制病毒基因E6、E7的表达,从而抑制它们的致癌作用,并可通过与p53、Caspase等相互作用影响细胞增殖,在HPV感染及致病过程中具有重要作用。

结核分枝杆菌对二线药物耐药性及机制研究进展

结核病耐药性的产生和传播已成为全球公共卫生工作的焦点。世界卫生组织（WHO）最新统计显示,全球有39万～51万例耐多药结核病（multi-drug-resistant tuberculosis,MDR-TB）,其中50%分布在印度和中国。

钩端螺旋体外膜蛋白的研究概况

钩端螺旋体外膜蛋白是钩端螺旋体外膜的重要组成成分,也是钩体一种重要的抗原分子。既有免疫原性又有免疫保护作用。大量的研究表明,钩体外膜蛋白是钩体重要疫苗分子之一。现就钩端螺旋体外膜蛋白的研究情况作一综述。

表达序列标签分析在血吸虫基因组研究中的应用

表达序列标签分析是借助于 10 0～ 40 0个核苷酸长度的标记引物 ,在随机选取cDNA克隆 ,进行 5’端或(和 ) 3’端进行大规模一次性测序 。

研究钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的免疫原性

目的研究钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的免疫原性。方法取健康豚鼠12只,分蛋白免疫组和PBS(磷酸盐缓冲液)对照组,每组6只。蛋白免疫组以Loa22重组蛋白50μg加等量完全弗氏佐剂乳化一免,Loa22重组蛋白配以不完全弗氏佐剂乳化二免和三免;对照组注射PBS与佐剂混合物。分别检测血清中抗体和T淋巴细胞增殖水平。结果在末次免疫后2周时血清抗体效价和T淋巴细胞增殖与对照组相比,均显著升高(P<0.05)。结论 Loa22重组蛋白有较好的免疫原性。

SjESG-2A锤头状核酶表达载体构建及其抗日本血吸虫虫卵发育研究

目的设计并合成日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因2A(eggshell protein gene 2A,ESG-2A)的特异性锤头状核酶并构建真核表达载体。探讨其在BALB/c小鼠体内的抗日本血吸虫虫卵发育作用。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,采用双酶切、琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定方法鉴定阳性克隆。以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠,建立动物模型。大量抽提阳性重组子,分别在小鼠感染时、感染后2w、感染后4w,将其经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,共3次。小鼠感染6w后计数成虫负荷及肝组织虫卵数。ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-4的水平。结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3.1(+)的XbaI和EcoR I酶切位点之间,命名为pcRz-ESG-2A。在核酶组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平呈先上升后下降;在空载体组和生理盐水组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平也呈上升趋势。核酶组免疫BALB/c小鼠能诱生减虫率25.64%和减卵率44.21%。结论成功合成SjESG-2A特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在已感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠体内具有抗日本血吸虫虫卵发育的作用。

淋球菌孔蛋白免疫功能的研究进展

淋球菌孔蛋白对淋球菌的存活和致病起着重要作用。它能促进淋球菌入侵宿主细胞,调控细胞凋亡,影响补体激活途径,充当免疫佐剂。深入研究孔蛋白的免疫功能,对阐明淋球菌的致病机制及宿主抗感染免疫机制具有重要意义。

衡阳地区梅毒螺旋体基因分型的实验研究

目的了解衡阳地区梅毒螺旋体(TP)的分子亚型的分布,为梅毒螺旋体感染分子流行病学研究提供实验依据。方法收集衡阳地区疑似硬下疳的标本52例,经TP polA PCR筛选后,阳性者用PCR扩增各标本中TP的ARP和TPR基因,酶切TPR基因扩增产物,分析各TP菌株ARP基因长度和TPR基因的限制性片段长度多态性(RFLP),进行分型。结果TP polAPCR阳性者43例,可用于分型者38例,分为10个亚型,其中14d亚型有16例,其它亚型包括10d(2)、12a(2)、12g(1)、13d(4)、14a(3)、14b(2)、14f(2)、15d(5)、16d(1)。结论衡阳地区存在TP的多亚型,且以14d亚型为主(42.1%)。

梅毒螺旋体重组蛋白在血清学诊断中应用的研究进展

梅毒是一种由苍白密螺旋体引起的可累及多器官系统的性传播疾病,其病程长、临床表现复杂多变。基因重组蛋白技术在梅毒血清学诊断中的应用广泛,推进了实验室梅毒临床诊断的快速发展,但仍无法突破早期诊断和疗效判断的瓶颈。近年来,许多新的梅毒重组蛋白,如感染依赖性抗原、假定蛋白、黏附相关蛋白、鞭毛蛋白、膜脂蛋白、表面蛋白等,被纳入梅毒血清学诊断的候选蛋白并进行了相应评价。对其深入研究可为梅毒早期诊断及治疗提供新靶标,且为研发梅毒新型疫苗提供新的理论基础和研究方向。