磷酸化PKM2调控糖尿病内皮依赖性血管舒张功能

目的:内皮依赖性血管舒张功能障碍是糖尿病性大血管病变的病理基础,内皮细胞对于高糖的利用及适应性改变决定了内皮细胞的功能状态。糖酵解途径是内皮细胞的主要能量来源,糖酵解异常在高糖诱导的内皮依赖性舒张功能障碍中发挥重要作用。M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2)是糖酵解途径关键酶之一,磷酸化可使其活性下降从而影响葡萄糖的糖酵解过程。TEPP-46可使PKM2稳定在四聚体形态,从而抑制其二聚体的形成和磷酸化。本研究采用TEPP-46作为抑制PKM2磷酸化的工具药探讨高糖条件下磷酸化PKM2(phosphorylated PKM2,p-PKM2)对内皮依赖性血管舒张功能的影响和潜在机制,以期为寻找糖尿病性大血管病变的新干预靶点提供理论依据。方法:将小鼠分为3组,其中野生型组(对照组,C57BL/6小鼠)和糖尿病组(db/db组,db/db小鼠)用羧甲基纤维素钠溶液每日灌胃1次;TEPP-46组(治疗组,db/db小鼠)用TEPP-46(30 mg/kg)和羧甲基纤维素钠溶液每日灌胃1次。各组小鼠分别处理12周后,检测胸主动脉p-PKM2和PKM2的蛋白质表达和血浆一氧化氮(nitric oxide,NO)水平以及胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能。高糖(30 mmol/L)伴或不伴TEPP-46(10μmol/L)、甘露醇孵育人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)72 h后,检测上清液中NO水平、细胞内NO含量及p-PKM2和PKM2的蛋白质表达水平。最后,在细胞水平和动物水平检测TEPP-46对内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)磷酸化的影响。结果:与野生型组相比,糖尿病组小鼠胸主动脉p-PKM2表达增加(P<0.05)。糖尿病组小鼠胸主动脉对乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)的反应性较对照组降低了47%(P<0.05),TEPP-46组小鼠胸主动脉对ACh的反应性较糖尿病组提高了28%(P<0.05);3组小鼠胸主动脉对硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)的反应性差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,糖尿病组小鼠血清NO水平降低;与糖尿病组相比,TEPP-46组胸主动脉p-PKM2表达降低的同时血清NO水平升高(均P<0.05)。高糖而非甘露醇可诱导HUVECs中p-PKM2表达增加,同时降低上清液中NO水平(均P<0.05)。TEPP-46和高糖同时孵育HUVECs,在抑制PKM2磷酸化的同时可逆转高糖所诱导的NO生成和分泌减少(均P<0.05)。在细胞水平和动物水平,TEPP-46均可逆转高糖所诱导的eNOS(Ser1177)磷酸化下降(均P<0.05)。结论:p-PKM2可能通过抑制p-eNOS(Ser1177)/NO途径参与2型糖尿病内皮依赖性血管舒张功能障碍的过程。