非洲猪瘟病毒O174L蛋白的真核表达载体构建及分子特征分析

为分析非洲猪瘟病毒O174L基因,通过同源重组方式将O174L基因连接至p RK5M-C-2×Strep载体,构建重组质粒,经PCR扩增和测序鉴定正确后,将重组质粒转染至猪小肠上皮细胞系(porcine intestinal columnar epithelial cells,IPEC-J2)中,通过免疫荧光和Western blot检测O174L蛋白的表达情况。PCR及测序结果显示,p RK5M-C-2×Strep-O174L重组质粒构建成功。免疫荧光和Western blot检测结果显示,O174L蛋白能够在IPEC-J2细胞中稳定表达。生物信息学分析结果显示,基于O174L基因和B646L(p72)基因序列构建各分离毒株的2个系统发育树间排列高度相似。来自中国的16株分离株中,O174L基因序列的相似性高达96.76%~100.00%。其中,与中国爆发的其他Ⅱ型分离株相比,China/2018/Anhui XCGQ在O174L蛋白的第67、75及110位氨基酸存在差异,GZ201801在第110位氨基酸存在差异。Ⅰ型分离株SD/DY-I/2021和HeN/ZZ-P1/2021的O174L蛋白的氨基酸序列分别在第13、73、93、95、113和114位上与其他中国Ⅱ型分离株存在差异。O174L蛋白为稳定的亲水蛋白,没有信号肽和跨膜区;其二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成,三级结构预测结果与二级结构预测相符。以上结果为深入研究ASFV O174L蛋白与宿主间的相互作用和遗传进化提供了基础。

增强拉曼光谱法快速筛查尿液中的芬太尼类物质的研究

利用表面增强拉曼技术对社会上滥用的4种芬太尼类物质,即苄基芬太尼、丙烯酰芬太尼、硫代芬太尼、乙酰芬太尼在尿液中与低痕量标准品水溶液中检出分析,建立一种快速、无损、准确的检验出芬太尼类物质新的分析方法。利用手持拉曼光谱仪和表面增强试剂在激光光源785nm,激光功率250mW,积分时间600ms的实验条件下对4种芬太尼类物质在尿液中和微量标准品水溶液中检出,测得其拉曼光谱图进行分析。对比分析物质的特征峰,得到样品的物质结构与特征峰的关系,并将在尿液中和低痕量标准品水溶液中芬太尼特征峰进行比对分析两种状态下的图谱拉曼位移变化和一致性。该方法无损检材、高效便捷,可以为公安机关在不同的环境中和材料中识别检验出芬太尼类物质提供技术支持。有望为科研工作者实现超低痕量检测,快速、灵敏、简单的检测手段提供新思路。

利用拉曼技术检测抗原抗体的研究与进展

判断病毒是否入侵体内,抗原检测、抗体检测是继核酸检测方法后最常用的两种检测技术。抗原检测主要是通过检测病毒的抗原,检测病原体对应的特异性抗体即为抗体检测。最近这几年随着病毒的增多,涌现出了大量新型的检测技术,其中,利用拉曼技术在抗原抗体的研究方面,不仅能快速与准确地检出,还能检测超低痕量的样品。本文聚焦于拉曼技术在抗原抗体检测中的研究进展,从应用拉曼光谱的方法入手,重点阐述了科研人员基于拉曼技术原理在不同样本的研究,并展望拉曼技术在实际应用中的前景。本文通过综述拉曼检测技术在不同抗原抗体中的研究与进展,有望为科研工作者实现超低痕量检测,快速、灵敏、简单的检测手段提供新思路。

精准基因编辑技术培育抗病种猪的发展与评价

抗病力性状改良一直以来都是猪遗传育种研究的重点,然而由于这类性状度量困难,而且遗传力相对较低,常规手段改良进展速度缓慢。因此,研究人员除了通过传统方法在培育种猪,还专注于利用基因编辑技术研究宿主基因来抑制病毒,培育高效抗病的种猪新品种。随着基于基因编辑技术的精准定位与修饰、脱靶效应的降低、生长因子调节等应用的完善,未来生猪养殖高效抗病基因编辑猪产业化将成为可能。该文分析了当前种猪业的发展现状,结合基因编辑技术的原理、伦理评价方面进行了综述,旨在为研究精准基因编辑抗病育种的广大科研工作者提供参考。

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪回肠上皮(immortal pig intestinal-2I,IPI-2I)细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体(pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5)共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞(片段敲除效率为15.5%),其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。