RelB对HIV-1 Vpr转录激活及诱导细胞G2/M期停滞功能影响的初步研究

Vpr是人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus type 1,HIV-1)的辅助蛋白之一,在病毒复制及AIDS进程中起重要作用。为了研究Vpr完成其生物学功能的分子机制,本研究利用酵母双杂交技术,从人的cDNA文库中筛选,并经免疫共沉淀技术证实NF-κB通路中的重要蛋白RelB与Vpr存在相互作用;发现RelB蛋白能促进Vpr介导的对NF-κB报告基因的激活,也能促进Vpr对HIV-1LTR的反式激活作用。利用流式细胞技术发现RelB促进Vpr诱导细胞周期G2/M期停滞。上述结果表明,RelB辅助Vpr完成其转录激活以及调控细胞周期的功能。

肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定

EV71是导致手足口病的主要病原体之一,其3D聚合酶作为依赖于RNA的RNA聚合酶,在病毒基因组转录及复制过程中发挥重要作用。当前,3D与宿主细胞的相互作用鲜有研究。酵母双杂交实验是研究蛋白质相互作用成熟有效的方法。本文将3D基因克隆至pGBKT7载体,构建了用于酵母双杂交实验的诱饵质粒,鉴定正确后转化酵母细胞AH109,依次检测了3D蛋白的表达、细胞毒性和自激活能力,结果表明3D基因可在AH109菌株中表达,对后者生长无显著影响,但融合蛋白具有自激活能力。进一步构建一系列含3D蛋白截短体的诱饵质粒,通过自激活实验界定了3D的最小转录激活域(1~94aa),为后续利用酵母双杂交技术研究与3D相互作用的细胞蛋白奠定了基础。

原型泡沫病毒Bel1蛋白核定位信号精细定位及相互作用核输入蛋白初探

Bel1是原型泡沫病毒(Prototype foamy virus,PFV)的反式激活因子,在病毒的复制周期中发挥关键作用。研究表明,Bel1含有核定位信号(Nuclear localization signal,NLS),但其精确氨基酸组成尚不明确,介导其入核的核输入蛋白亦未见报道。本研究利用插入Bel1截短片段的EGFP-GST融合表达体系,通过绿色荧光观察其亚细胞定位,首次精确确定Bel1NLS序列为215PRQKRPR221;定点突变明确了K218、R219和R221为Bel1核定位的必需残基,证明Bel1NLS属单分型核定位信号;GST-Pulldown实验显示这段序列可与α核输入蛋白(Importinα/Karyopherin alpha,official symbol:KPNA)KPNA1、KPNA6和KPNA7相互作用,即Bel1可能藉此转运入核。

EV713C蛋白酶与ZMYM2相互作用及功能初探

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)为小RNA病毒科肠道病毒属A组病毒的代表株,感染可引发手足口病(Hand-foot and mouth disease,HFMD),严重危害儿童健康。EV713C蛋白酶(3C)是其编码的主要蛋白酶之一,在病毒多蛋白加工过程中发挥关键作用,同时切割细胞蛋白以利于病毒复制。为进一步了解EV71与宿主间博弈关系,本课题组前期以3C为诱饵进行酵母双杂交实验,筛选与3C发生相互作用的可能底物,钓取到锌指MYM型蛋白2(Zinc finger MYM-type protein 2,ZMYM2)。ZMYM2是一种具有锌指结构的转录因子,与细胞中重要的抗病毒小体PML核体(PML nuclear bodies,PML-NBs)的形成及稳定性相关。本文选择3C与ZMYM2关系展开研究,确证二者相互作用并初探生物学功能。首先通过免疫共沉淀实验确证3C与ZMYM2之间存在相互作用;随后分析功能,发现过表达ZMYM2抑制EV71复制;敲减内源ZMYM2有利于EV71的复制;分析3C对ZMYM2影响,发现3C剂量依赖性切割ZMYM2,ZMYM2上至少具有2个3C的识别位点。本研究为解析ZMYM2功能及进一步了解EV71与宿主先天免疫间博弈关系提供了新的实验证据。