肿瘤相关免疫抑制细胞与免疫逃逸机制研究进展

肿瘤相关树突细胞,髓系来源抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞等在肿瘤免疫逃逸过程中能够诱导免疫抑制反应。肿瘤源性因子可以影响其分化、功能和迁移。细胞内信号转导途径的激活可以调节细胞内代谢、细胞因子的产生和共刺激及共抑制分子的表达,由此产生免疫抑制作用。这些方面的研究将会为抗肿瘤免疫治疗提供新的策略。

同源异型盒基因BP1在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

背景与目的BP1(beta-protein1)基因是新近发现的转录因子,定位于染色体17q21-22,属同源异型盒基因DLX家族,在急性髓系白血病和急性T淋巴细胞白血病中均呈过度表达。本研究通过观察BP1mRNA在乳腺癌中的表达情况,分析并探讨其与乳腺癌临床病理特征的关系。方法以β-actin基因作为参照,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测82例乳腺肿瘤组织、12例近端肿瘤旁组织和10例远端癌旁组织中BP1mRNA的表达。结果82例肿瘤组织中有53例BP1阳性(64.63%),而在近端癌旁组和远端癌旁组中则表达很弱(16.67%)或不表达(0%),差异具有统计学意义(P<0.05)。BP1基因的过表达与组织学分级有关(P<0.05),而与肿瘤大小、有无淋巴结转移、病理类型、肿瘤家族史、初潮年龄、初产年龄、怀孕次数、绝经状况、雌激素受体及孕酮受体状态无关。结论BP1基因在部分乳腺癌中上调,其表达与肿瘤组织学分级有关。

IL-6对M1型巨噬细胞向肿瘤相关M2型巨噬细胞转化过程的诱导作用

目的共培养小鼠M1型巨噬细胞RAW264·7与乳腺癌细胞4T1,观察白介素6(IL-6)在M1型巨噬细胞向肿瘤相关M2型巨噬细胞转化过程中的作用。方法实验共分为以下3组:A组(4T1细胞),B组(RAW264·7细胞),C组(RAW264·7与4T1以1∶4比例混合培养)。流式细胞技术检测M2型巨噬细胞比例,随后加入IL-6特异性抑制剂激活素A(ACTA,25μg/ml)或重组IL-6(rIL-6,10μg/ml)后再行检测。RT-PCR检测M1、M2型巨噬细胞功能相关细胞因子及IL-6、IL-6Rα的mRNA表达量。ELISA法检测3组细胞上清中IL-6的含量,随后改变两种细胞的混合比例后再行检测。结果RAW264·7和4T1细胞共培养后,M2型巨噬细胞比例显著增加,添加ACTA后该比例显著下降,而添加rIL-6后该比例增加。与B组比较,C组的M2型巨噬细胞相关细胞因子(CCL22、CCL2、YM1、PDGF-c、HIMP、MMP-9、IL-10)mRNA表达水平明显增高,M1型巨噬细胞相关因子(IL-12、IL-15、IL-18)mRNA表达水平明显降低。IL-6mRNA在A组呈微量表达,在B组无表达,在C组表达明显增高,而IL-6RαmRNA在3组中均呈高表达。与A、B组比较,C组细胞上清液中IL-6含量明显增加(P均<0·05);以不同比例将两种细胞混合后发现RAW264·7细胞数量的改变显著影响了共培养细胞上清中IL-6的水平。结论将4T1和RAW264·7细胞共培养后,前者能促进后者分泌IL-6,并诱导其向肿瘤相关M2型巨噬细胞转化。IL-6在转化过程中发挥重要作用,阻断其作用可以遏制转化。

不同Toll样受体介导的树突状细胞因子表达

目的研究树突状细胞在不同Toll样受体(TLR)配体刺激下的早期反应。方法将鼠骨髓细胞诱导分化得到DC,利用TLR配体刺激,采用芯片分析方法研究其免疫相关基因在9h的表达;采用细胞因子分析系统,检测了12、48h细胞培养上清中细胞因子、趋化因子的产生。结果在给予LPS、PolyI:C、R848、CpG和anti-CD40刺激9h后,IL-1、IL-2rg、IL-13、CCL2、CCL4和CCL7的基因表达明显升高,CCL3、CCL5和CXCL9、CXCL10、CXCL11的表达增加最为显著(P<0.01);而IL-10(PolyI:C除外),CCL-6的表达降低(P<0.05)。培养12h后,IL-1、IL-6、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、TNFa、G-CSF、GM-CSF、KC和MIP-1a(CCL3)产生在5种TLR配体刺激下均显著增加(P<0.01);培养48h后,IL-1、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、TNFa、IFN-γ、G-CSF和MIP-1a(CCL3)产生也同样显著增加(P<0.01)。相对于其它TLR配体,CpG刺激时MIP-1a(CCL3)的产生增加更明显,与基因芯片结果相似。结论本研究揭示了不同TLR配体刺激对DC细胞因子和趋化因子表达量的调节,为TLR配体对DC分化和功能的作用机理提供了更多证据。

APOE对鼠RAW264.7细胞系内TLR信号通路的调节

目的分析载脂蛋白E基因(APOE)对RAW264.7细胞内的TLR信号通路的调节作用。方法克隆鼠APOE基因并建立表达APOE的RAW264.7稳定细胞系,使用各种Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)配体进行刺激,用报告基因化学发光检测转录因子活性,流式细胞仪检测细胞表面免疫分子。结果在LPS刺激下,APOE基因抑制NF-κB的活性(P<0.05),但对AP-1活性有促进作用(P<0.05);在PolyI:C刺激下,APOE促进NF-κB和AP-1两者的活性(P<0.05)。在PGN刺激时,APOE明显上调B7-H1的表达,但对CD86、PD-1、CD11c及Gr-1的表达有抑制作用。结论APOE基因可以调节TLR信号通路中NF-κB的活性,也可调节多个具有免疫调节功能的表面分子的表达,这样APOE可能具有免疫调节功能。

SerpinH1对小鼠肿瘤细胞增殖的影响

目的研究SerpinH1基因对肿瘤细胞增殖的影响。方法克隆SerpinH1基因,建立相关稳定转染细胞系,分为5组,分别为空白对照组,pcDNA3.1/V5-SerpinH1实验组,pcDNA3.1/V5对照组,pNKRY-SerpinH1-siRNA实验组,pNKRY-GFP对照组。应用BrdU渗入法,流式细胞术检测,WST-1方法分别测定细胞增殖情况,并建立肿瘤细胞模型,用体内试验验证SerpinH1对肿瘤细胞生长情况的影响。结果过表达基因的pcDNA3.1/V5-SerpinH1组肿瘤生长有抑制作用,而用siRNA干扰技术沉默基因表达的pNKRY-SerpinH1-siRNA组肿瘤生长有促进作用。结论SerpinH1基因能够抑制肿瘤细胞生长,提示SerpinH1具有抑制肿瘤的功能。

Prosaposin基因对TLR3信号途径的调节

目的研究prosaposin基因对转录活性因子和免疫细胞表面分子表达的影响,分析该基因在各种Toll-like re-ceptor不同途径中的作用,初步探讨prosaposin基因在免疫系统中的功能。方法克隆prosaposin基因并建立prosaposin基因稳定转染的细胞系,通过检测报告基因化学发光和用不同Toll-like receptor配体刺激后比较细胞表面分子的表达水平的方法来探讨不同途径中该基因发挥的作用。结果在TLR3配体PolyI:C刺激条件下,prosaposin基因能够明显促进对NF-κB以及AP-1的活性,而且明显抑制细胞表面分子B7H1和PD1的表达。结论prosaposin基因能够影响TLR3信号途径作用于免疫细胞,调节免疫相关细胞分子,可能在免疫系统方面起作用。

Fractalkine、IP-10及不同信号通路抑制剂对肿瘤微环境中NK细胞的影响

目的探讨Fractalkine(FKN)、干扰素诱导蛋白10(IP-10)以及不同信号通路抑制剂对肿瘤微环境自然杀伤(NK)细胞数目和功能的影响。方法免疫组化染色观察人乳腺癌组织中CD56和DAP10的分布情况。通过共培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7与小鼠乳腺癌细胞4T1模拟体外肿瘤微环境(数目比例1:4),以小鼠NK细胞KY-1为研究对象。RTPCR检测肿瘤微环境中KY-1细胞表面活性受体CD16、NKG2D及NK1.1的表达;ELISA检测培养细胞上清CD107a的含量。在肿瘤微环境中加入10ng/ml FKN及10ng/ml IP-10,流式细胞术测定NK1.1+CD16+KY-1细胞的数量;趋化及黏附实验评价其迁移和黏附功能的变化。最后,以10nmol/L雷帕霉素、30μmol/L LY294002、500ng/μl穿心莲内酯、2μmol/L渥曼青霉素分别处理4T1细胞,收集上清分别孵育RAW 264.7细胞48h后,RT-PCR检测4T1、RAW 264.7 m RNA及两种混合m RNA中Rae1α、H60a的表达。结果肿瘤微环境中,KY-1细胞NK1.1+细胞比例、趋化率及黏附功能明显下降,加入FKN和IP-10后以上各项指标明显增高,不同信号通路阻滞剂使4T1细胞对NK细胞杀伤作用的敏感性均有不同程度提高,以雷帕霉素作用最为明显(P<0.05)。结论 FKN、IP-10可上调肿瘤微环境中NK细胞的数目和功能,雷帕霉素等通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体(Rae1、H60a),间接促进NK细胞的杀伤活性。

RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节

目的:研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法:通过克隆RGS1基因、转染RAW264.7细胞、建立稳定转染的细胞系,利用流式细胞术检测,基因芯片分析初步探讨RGS1基因的功能。结果:RGS1基因能够抑制NF-κB转录因子活性;RGS1基因明显增加RAW264.7细胞表面CD86分子的表达,降低CD80表达;在不同Toll样受体配体刺激后,CD40、CD80和PD1水平低于对照组。同时,RGS1基因使IL-6、IL-15的表达明显升高,IL-10、IL-1的表达明显降低。结论:RGS1基因可调节免疫相关细胞表面分子和细胞因子的分泌,影响Toll样受体信号通路,表明RGS1可能在免疫调节方面起重要作用。

氯化钆减轻肝脏缺血再灌注损伤的实验研究

目的:探讨氯化钆(Gadolinium Chloride,GdCl3)抑制肝脏枯否细胞对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法:雌性Wistar大鼠30只随机分为3组,对照组只开腹和关腹,术前24h、48h经鼠尾静脉注射生理盐水,每次7mL/kg;肝脏缺血再灌注(I/R)组术前24h、48h经鼠尾静脉注射生理盐水,每次7mL/kg;氯化钆+肝脏缺血再灌注(GdCl3+I/R)组,术前24h、48h经鼠尾静脉注射0.2%氯化钆溶液,每次7mL/kg。第3天进行肝脏部分缺血再灌注手术(10%水合氯醛麻醉,上腹正中开口)。缺血30min后,原位血液再灌注2h。取肝中叶组织,制备10%组织匀浆用于乳酸脱氢酶(LDH)活力的测定;分离肝细胞,进行细胞凋亡与坏死检验;抽提肝组织细胞总RNA,利用RT-PCR法检测IL-10mRNA表达。结果:部分肝脏缺血再灌注后,I/R组LDH活力明显低于对照组(P<0.05),也低于GdCl3+I/R组(P<0.05);I/R组肝细胞大量死亡,GdCl3+I/R组中有早期凋亡肝细胞和晚期凋亡肝细胞,死亡肝细胞大大减少;I/R组IL-10表达量明显增多,GdCl3+I/R组IL-10表达量相对较少,对照组IL-10基本不表达。结论:氯化钆能够抑制枯否细胞吞噬、分泌功能,具有减轻肝脏缺血再灌注的损伤作用。

集落刺激因子-1及其受体对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤生长的影响

目的 探讨CSF-1及其受体对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤体积以及对其免疫器官包括骨髓、胸腺、淋巴结和脾的影响。方法 将4T1细胞(1×107/只)重悬于PBS液接种于Balb/c小鼠左腋皮下,建立荷乳腺癌小鼠模型为实验组,同时培养相同条件的对照组。检测成瘤率,测量肿瘤体积的变化并绘制成图;成瘤后为实验组小鼠注射CSF-1及其受体,观察一段时间后同时处死两组小鼠,采用半定量RT-PCR技术检测鼠脾脏中CSF-1的表达;采用MTT比色法检测小鼠的肿瘤、脾脏、骨髓中细胞的增殖功能。结果4T1细胞接种后小鼠的成瘤率为100%,成瘤潜伏期平均为7~10天;实验组小鼠瘤体的增长速度快于对照组;RT-PCR的电泳结果显示,实验组小鼠的脾脏CSF-1的mRNA的表达量上升;MTT结果表明,CSF-1作用之后的实验组小鼠的肿瘤细胞和免疫细胞增殖活性升高,发挥了强大的免疫抑制功能,促进肿瘤的增长;增殖活跃的骨髓和脾细胞呈现免疫抑制表型。结论 CSF-1及其受体对乳腺癌荷瘤鼠肿瘤的生长有促进作用。

人RGS1基因克隆表达及其功能分析

目的克隆并构建人RGS1表达载体,转染U937细胞和树突细胞,进行功能分析。方法通过RT-PCR方法克隆人RGS1基因,将其连接到pcDNA 3.1/V5表达载体。然后以连接的质粒为基础通过报告基因化学发光及ELISA方法对人RGS1基因的进行初步分析。结果经扩增及序列测定表明pcDNA-RGS1质粒构建成功,在U937细胞和树突细胞中可以表达。RGS1对U937细胞转录因子NFκ-B的活性有明显的抑制作用,同时明显上调树突细胞细胞因子IL-6的表达。结论在pcDNA-RGS1质粒成功构建基础上,证明了人RGS1基因具有免疫调节功能,为进一步研究其免疫应答中的调节作用奠定了基础。

应激对小鼠乳腺癌生长转移的作用及机制

目的 探讨应激对小鼠乳腺癌生长转移的作用及机制。方法 6~8周龄BALB/c小鼠接种4T1细胞制备乳腺癌移植瘤模型,分为对照组、慢性应激组、Iso[异丙肾上腺素,10mg/(kg.d)]组、慢性应激+DMSO(二甲基亚砜)组和慢性应激+Rapa[雷帕霉素,15mg/(kg.d)]组。记录癌组织体积变化,并于造模第21天处死小鼠,检测瘤内Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和p62表达变化;同时进行肺墨汁染色,计数小鼠肺内转移结节。采用去甲肾上腺素(NE)处理4T1细胞,观察自噬相关分子Beclin1、LC3-Ⅱ、p62mRNA和蛋白表达的变化。结果 与对照组[(1359.7±173.9)mm^3]相比,应激刺激[(2119.7±130.0)mm^3]和Iso注射[(1947.0±102.8)mm^3]可促进乳腺瘤体的生长(P<0.05),同时,肺内转移结节数也呈现同样的变化趋势[慢性应激组(10.3±1.1)个,Iso组(8.8±0.5)个vs.对照组(4.3±0.3)个,P<0.05];慢性应激组瘤内Beclin1、LC3-Ⅱ表达减少,而自噬的抑制性分子标志物p62表达增加(P<0.05);自噬诱导剂Rapa可逆转应激的促瘤效果[(2275.477±187.397)mm^3vs.(1360.097±213.938)mm^3,P<0.05]。与生理盐水组相比,NE处理后4T1细胞内Beclin1表达减少约60%(100%vs.39.8%±2.0%,P<0.05),绿色荧光蛋白(GFP)-LC3的点状聚集也明显减少(P<0.05)。生物信息学分析显示高表达Beclin1的乳腺癌患者生存预后更好,高表达p62者则正相反(P<0.001)。结论 应激通过抑制细胞自噬促进乳腺癌的生长和转移。

Toll样受体相关因素对小鼠血细胞分化的促进与抑制作用

Toll样受体（TLR）是一种天然免疫受体，识别各自配体后，通过MyD88或不依赖MyD88途径，活化下游MAPK和NF-κB信号途径，从而激活树突状细胞（DC）成熟而导致DC释放细胞因子。为初始淋巴细胞的激活和分化提供必要的共刺激信号，启动适应性免疫应答。DC作为一种专职抗原提呈细胞，其功能又受其所处的微环境和病原体及其产物的调节，并且已经证明病原体及其产物可通过特异性基因表达而从不同的通路使DC成熟，从而进一步影响淋巴细胞的增殖。