热稳定α-淀粉酶稳定性工程菌的构建

本文以质粒pE194为载体亚克隆B.licheniformis热稳定α-淀粉酶基因,构建成重组质粒pNW102,通过噬菌体PBS1将它转导进入中温α-淀粉酶生产菌B.subtilis BF7658。B.subtilis BF7658(pNW102)经过长时间非许可温度处理,筛选得到2株热稳定α-淀粉酶稳定性表达的工程菌株。酶学分析显示同源重组具有热点,2株重组菌株B.subtilis BFNW产生的热稳定α-淀粉酶符合B.licheniformis产生的淀粉酶特性。

信号肽C—端和成熟蛋白N—端氨基酸序列的变化时α—淀粉酶分泌作用的影响

本文利用ｐＡｍｙ４１３质粒通过定点诱变技术，在α－淀粉酶基因的２８７和２９１位分别引入１个Ｇ和Ｃ，代替原来的Ｔ和Ｇ，构建成质粒ｐＡｍｙ４１３Ｂ，使成熟的α－淀粉酶Ｎ－端（７）Ｌｅｕ（８）Ｍｅｔ变为（７）Ａｒｇ（８）Ｉｌｅ。ｐＡｍｙ４１３Ｌα－淀粉酶信号序列因引入１个多酶切点接头而比ｐＡｍｙ４１３的２９个氨基酸增加了１３个氨基酸，创造了１个新的信号肽酶Ｉ识别窗口Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ａｌａ↓Ｓｅｒ，利用计算机对该信号肽进行了二级结构分析。这两株突变株产酶能力分别为野生株（ｐＡｍｙ４１３）的３％和３６％；胞外α－淀粉酶的分子量同于野生株；末端分析显示，成熟酶第一个氨基酸为Ａｌａ，表明信号肽酶Ｉ在野生型识别窗口Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ↓Ａｌａ处切割。结果还表明，Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶在Ｂ．

α－淀粉酶基因表达中启动子上游区EcoRI－BclI片段的生理功能

本文从ｐＡｍｙ４１和ｐＮＬ２０１出发，构建了一系列α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段缺失或部分缺失的质粒，并构建了含有ｐＡｍｙ４１系列单质粒ｐＡｍｙ４１系列、ｐＮＬ２０１系列双质粒工程菌。通过对这些工程菌α－淀粉酶基因表达水平的分析显示，Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段在α－淀粉酶基因表达中行使负的调控功能。

以淀粉酶基因为筛选标记的E.coli克隆载体的构建

以E．coli质粒pJRD184为基础，将多酶切点引入地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的a－淀粉酶基因信号肽编码区的PstI切点，构建了能表达并将a－淀粉酶（Amy）渗漏到胞外的E．coli克隆载体pLAM9712．该载体可根据在含有可溶性淀粉的LB平板上菌落周围有没有淀粉水解圈直接筛选重组子，从而避免了使用异丙基硫代－β－D－半乳糖苷（IPTG）、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D一半乳糖苷（X－gal），代之以廉价的碘、淀粉．实验进一步验证了pLAM9712在基因克隆中的可行性及质粒本身的稳定性．