短小芽孢杆菌作为芽孢杆菌属基因工程受体菌的研究

以质粒pUB110 DNA转化B. pumilus 289原生质体,转化频率为10^(-3)—10^(-9)与B.tubtilis 168系统相当;但B.pumilus 289原生质体的再生频率(0.3—12.0％)略低于B.subtilis 168(1.53—24.16％);在无选择压力条件下质粒pUB110在B.pumilus 289中经过45个世代周期,自发丢失率小于3％,同于B.subtilis 168系统。外源基因在B.pumilus 289中经25个世代周期丢失率低于5％,而在B.subtilis 168系统中则高达24％;外源基因的表达水平亦高于B.subtilis 168系统。因此,B.pumilus 289是一个值得进一步开发的基因工程受体系统。

枯草芽孢杆菌BF7658α-淀粉酶的性质

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BF7658产生的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)在免疫学上与解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)产生的液化型α-淀粉酶相同。并且二者的α-淀粉酶的淀粉水解产物的层析谱带相同,分子量相等(约55000道尔顿),等电点相近(5.12和5.28);B.subtilis Marburg 168α-淀粉酶分子量为64000道尔顿,等电点为6.12。因此,B.subtilis BF7658产生的α-淀粉酶是液化型α-淀粉酶。因而建议将B.subtilis BF7658改名为B.amyloliquefaciens BF7658。

外源质粒在枯草芽孢杆菌BF7658中的稳定性及其基因表达

通过B.subtilis噬菌体PBSI转导,已将携带热稳定α-淀粉酶基因的质粒pAmy411引进了B.subtilis BF7658.转导频率为10_(-9)转导子/PFU。尽管pAmy 411的诲贝数在B.subtilis BF7658中较在B.subtilis AS 1.1176中高1倍,但其传代稳定性却较后者低。质粒携带的热稳定α-淀粉酶基因的表达水平在B.subtilis BF 7658中较在B.subtilisAS1.1176中高6倍。

携有巨大芽孢杆菌淀粉酶基因的两种质粒在枯草杆菌中产酶性质的比较

携带巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium糖化型α淀粉酶基因的质粒pBX95和pBX96(pBX96在枯草杆菌中传代对自发缺失0.65kb片段的衍生质粒)在枯草杆菌Bacillus subtilis中表达的α淀粉酶分子量分别为64 kD和58kD。它们的比活力相差两倍。并且在等电点、米氏常数、最适温度、最适pH、热稳定性方面均有差别。但二者的淀粉水解产物的层析谱带相同。

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）α-淀粉酶基因克隆到短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和 DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适 pH 为6.0;在 pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子 Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+、K+对酶略有激活作用;3×10-3mol/L 对氯汞苯甲酸（PCMB）对酶有95%的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）所产生的α-淀粉酶相同。

转座子Tn917在短小芽孢杆菌中的转座作用

粪链球菌(Streptococcus faecalis)转座子 Tn917已成为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)遗传操作中的一个很有用的工具。Tn917长度为5.4 kb,携带可诱导的红霉素抗性基因,并具有与革兰氏阴性细菌 Tn3族转座子类似的末端重复序列。质粒 pTV32是 pTV1的一个衍生质粒,它保留着质粒 pTV1的复制温度敏感特性,并可形成 lacZ 基因转座融合,因而可用来研究有关基因的表达调控机制。本文报道了载体质粒 pTV32在短小芽孢杆菌(B.pumilus)中的稳定性和 Tn917的转座及其插入诱变效应。

巨大芽孢杆菌淀粉酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

以λ噬菌体为载体,采用鸟枪法由B.megaterium基因组克隆得到了1个淀粉酶基因,并已被亚克隆到E.coli和B.subtilis中,其表达水平较B.megaterium高250倍。克隆株产生的淀粉酶对直链淀粉的早期水解产物主要为麦芽三糖和麦芽糖,随着水解时间的延长,又将它们转变为葡萄糖。同时能以麦芽三糖为底物水解为麦芽糖和葡萄糖。受体菌的平行提取物无上述水解活性。因而该酶被确定为糖化型α-淀粉酶。SDS-凝胶电泳法确定酶分子量为58000道尔顿。

芽孢杆菌分泌型表达载体的构建

以地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶信号肽编码区为基础构建了具有Pst Ⅰ、Nhe Ⅰ、Sma Ⅰ、BamH Ⅰ、Sal Ⅰ多酶切点的芽孢杆菌分泌型载体pAMY403,其分泌效率与质粒pAMY 413相同,而表达水平提高了50%,并能使外源β-内酰胺酶基因正常表达和分泌。质粒pAMY403的多酶切点可以满足外源基因插入产生非融合蛋白质,也可满足以三种不同读码框架插入外源基因产生融合蛋白质,因而能适应构建不同分泌型工程菌株的要求。