油茶根际土壤拮抗菌分离鉴定及其对油茶炭疽病的防效

油茶炭疽病是由多种真菌引起的主要危害油茶叶片和果实的病害,其发生严重时会影响油茶的产量。为从土壤中寻找对油茶炭疽病具有生防潜力的拮抗菌,通过稀释涂布平板法分离出可人工培养的微生物与指示菌平板对峙试验,经过初筛和复筛确定目标菌株。对目标菌株进行形态特征观察、生理生化鉴定及功能验证。利用盖玻片斜插法于显微镜下观察目标菌株对指示菌菌丝的影响,并进行抑菌谱试验。利用离体刺伤接种试验,验证目标菌株对油茶炭疽病发生的防治效果和治疗效果。通过16S rDNA基因扩增技术、gyrA基因扩增技术,对目标菌株进行分子鉴定。结果表明:从土壤中分离出可培养不同菌落形态的菌株34株,结合初筛、复筛,将菌株YFB-10-3-2确定为目标菌株。菌株YFB-10-3-2具有产生解淀粉酶、解纤维素酶、蛋白酶的能力和固氮功能,能使指示菌菌丝膨大、弯曲。进一步试验发现,目标菌株对10种病原菌的抑制率为46%~72%,表明该菌株具有抑菌广谱性。室内试验发现,该菌株对油茶炭疽病有68.11%的预防效果和28.60%的治疗效果,结合形态特征和生理生化试验,通过双基因分子鉴定,将菌株YFB-10-3-2鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。综上,菌株YFB-10-3-2具有开发成为油茶炭疽病生防菌剂的巨大潜力。

油茶炭疽病复合病菌鉴定及室内药剂评价

【目的】探讨油茶炭疽病复合病菌种类,筛选油茶炭疽病复合病菌的高效杀菌剂,为科学防治油茶炭疽病提供依据。【方法】从湖南、广西、广东、江苏,海南等地油茶成林采集炭疽病叶样本,采用组织分离法分离纯化致病菌,结合形态学和多基因联合系统发育分析进行种类鉴定;通过复合侵染试验研究致病菌之间的关系;采用菌丝生长速率法测定杀菌剂咪鲜胺、苯醚甲环唑、嘧菌酯、啶氧菌酯,氟吡菌酰胺和啶酰菌胺对油茶致病菌的室内毒力。【结果】1)从106个油茶炭疽病病斑中分离获得186株致病菌,其中主要病原菌是炭疽属真菌130株,拟盘多毛孢属真菌18株,新拟盘多毛孢属真菌28株,假拟盘多毛孢属真菌4株,链格孢属真菌6株;分离出单一炭疽病菌的病斑55个,而能同时分离出炭疽病菌和其他致病菌的病斑有51个,其中同一个病斑能同时分离出同属不同种或不同属致病菌的病斑有51个,分离的不同病菌有7种组合方式:同属不同种炭疽菌、炭疽菌和拟盘多毛孢属真菌、炭疽菌和新拟盘多毛孢属真菌、炭疽菌和假拟盘多毛孢属真菌、炭疽菌和链格孢属真菌两两组合以及炭疽菌和拟盘多毛孢属和新拟盘多毛孢属、炭疽菌和拟盘多毛孢属和链格孢属真菌3种菌的组合。2)将炭疽菌属和拟盘多毛孢属,炭疽菌属和新拟盘多毛孢属,炭疽菌同属不同种这3种分离率最多的组合方式致病菌回接到油茶上,发现炭疽病菌和其他致病菌复合接种的病斑显著大于只接同种病菌的病斑,表明油茶炭疽病斑中存在炭疽病菌与其他病原菌复合侵染协同增效的现象。3)室内毒力测定结果显示,苯醚甲环唑和咪鲜胺对炭疽菌属,拟盘多毛孢和新拟盘多毛孢致病菌均具有较强的抑制作用,平均EC50在0.011~0.555μg·mL^(-1)之间;其次是嘧菌酯和啶氧菌酯,这2种药剂对拟盘多毛孢和新拟盘多毛孢的室内毒力最强,平均EC50在0.007~0.020μg·mL^(-1)之间,但对炭疽菌的抑制作用较差;而啶酰菌胺和氟吡菌酰胺对油茶炭疽菌和拟盘多毛孢属致病菌几乎没有抑制作用。【结论】油茶炭疽病斑中存在炭疽菌和其他病菌复合侵染现象,咪鲜胺和苯醚甲环唑可作为防治油茶炭疽病复合侵染的主选药剂。

降香黄檀叶枯病菌的鉴定及其生物学特性

近年来,降香黄檀叶枯病的危害越来越严重,为深入了解该病菌特征,本研究对该病原菌进行鉴定,以期为制定更有效的防治措施提供依据。本研究对降香黄檀叶枯病病株进行病原菌分离,并对病原菌进行了形态学观察及rDNA-ITS序列测定,确定该病原菌为天门冬拟茎点霉菌[Phomopsis asparagi (Sacc.) Bubak]。通过观察该病原菌在不同培养基、温度、pH、光照等4种环境因素中的生长情况,发现该病原菌在马铃薯果糖琼脂培养基(PFA)中菌丝生长最快;菌丝在10~30℃均能生长,最适宜的生长温度为25~30℃;最适宜的pH为6;光照对该病原菌的生长没有显著影响。

果生炭疽菌转录因子CfHac1的BRLZ结构域生物学功能研究

【目的】炭疽病是油茶的主要病害,导致巨大的经济损失。果生炭疽菌是油茶炭疽病优势致病菌。对果生炭疽菌的转录因子CfHac1的结构域进行分析,为进一步解析转录因子CfHac1调控病菌致病的分子机制奠定基础,对挖掘油茶炭疽病防控新途径具有重要的理论意义。【方法】采用点突变技术构建转录因子CfHac1结构域缺失载体,通过PEG介导法将该回补载体转化至CfHAC1基因完全缺失突变体的原生质体中,通过博来霉素抗性和荧光筛选获得结构域缺失回补菌株,进一步研究BRLZ结构域在果生炭疽菌中的生物学功能。【结果】结果发现转录因子CfHac1含有一个碱性亮氨酸拉链结构域(BRLZ),该结构域包含58个氨基酸残基;与野生型菌株和完全互补菌株相比,BRLZ结构域缺失突变株ΔCfhac1^(ΔBRLZ)生长速率显著降低,分生孢子产量显著减少,不能形成附着胞,对内质网压力胁迫更敏感,丧失对油茶叶的致病力,其表型与ΔCfhac1突变体一致。【结论】上述结果表明,BRLZ是转录因子CfHac1重要的结构域,对CfHac1在果生炭疽菌中行使正常的生物学功能具有重要的调控作用。

自噬相关蛋白CfAtg8在果生刺盘孢中的功能分析

油茶炭疽病是由刺盘孢属Colletotrichum真菌引起的重要病害,在中国各油茶产区均有发生,严重威胁茶油的产量与品质。前期发现果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病的优势致病菌,自噬相关蛋白Atg8在果生刺盘孢中的生物学功能尚不清楚。本研究根据同源重组的原理及PEG介导的原生质体转化方法,获得了CfATG8基因敲除突变体及其互补菌株。进一步通过生物学表型分析,发现突变体生长减慢、产孢量减少、附着胞形成率降低、对细胞壁完整性胁迫耐受性降低,并且丧失对油茶的致病性。上述结果表明,CfAtg8参与调控果生刺盘孢的营养生长、无性繁殖、附着胞形成、对外界胁迫应答及致病过程。

丝裂原活化蛋白激酶基因CfMKK1调控果生炭疽菌的生长发育和致病力

【目的】由果生炭疽菌引起的炭疽病是油茶的主要病害,造成油茶产量下降。本文研究果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1的生物学功能,旨在为解析油茶炭疽病菌的致病机理提供依据。【方法】根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段,采用PEG介导法将载体导入原生质体中筛选获得突变体菌株DCfmkk1;PCR扩增果生炭疽菌含有启动子的CfMKK1基因回补片段,构建回补载体pYF11::CfMKK1;采用PEG介导法把回补载体转化至突变体的原生质体中,荧光筛选回补菌株ΔCfmkk1-C。测定野生型菌株、突变体菌株DCfmkk1及基因回补菌株ΔCfmkk1-C在营养生长、附着胞形成、胁迫应答和致病力等生物学表型。【结果】与野生型和回补菌株相比,CfMKK1基因敲除突变体ΔCfmkk1菌丝生长速率明显减缓;在含刚果红的PDA培养基上菌丝生长受到明显抑制,无法穿透玻璃纸,丧失了侵染寄主的能力;而且无法形成附着胞。【结论】研究结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的生长发育、附着胞形成、致病力以及响应外界胁迫过程。

油茶果生炭疽菌小分子GTP酶Rab7的功能研究

【目的】炭疽病是油茶的一种重要病害,果生炭疽菌是油茶炭疽病的主要致病菌。本文对果生炭疽菌小分子GTP酶Rab7进行研究,为油茶炭疽病的防控治理提供依据。【方法】构建CfRAB7基因敲除载体,通过PEG介导的原生质体转化、抗性筛选和PCR电泳验证获得果生炭疽菌突变体菌株△Cfrab7和互补菌株△Cfrab7/CfRAB7。进一步分析CfRAB7基因敲除突变体△Cfrab7的生长、产孢、附着孢的形成、胁迫应答、液泡融合和致病力等生物学表型。【结果】在PDA和MM培养基上,突变体△Cfrab7的菌落直径显著减小,产孢量和附着孢形成率显著降低,且不能穿透玻璃纸;在10mmol/L H_(2)O_(2)条件下,△Cfrab7生长受到明显抑制;进一步研究发现突变体△Cfrab7液泡无法正常融合,在油茶有伤和无伤的幼叶上均不发病。【结论】CfRAB7基因参与调控果生炭疽菌生长产孢、附着孢形成、H2O2胁迫应答、液泡融合和致病力。

bZIP转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长发育和致病力

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要病害之一,引起该病害的主要致病菌为果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola。本研究以果生刺盘孢菌bZIP类转录因子CfHac1为研究对象,研究其在果生刺盘孢菌的营养生长、产孢量、附着胞形成、致病力及耐受性等方面的生物学功能,为油茶炭疽病的防控提供理论依据。研究结果表明,果生刺盘孢菌中具有一个与灰色大角间座壳(稻瘟菌)bZIP转录因子MoHac1直系同源的基因,命名为CfHAC1。该基因全长1627bp,编码526个氨基酸,该蛋白含有一个碱性亮氨酸链(bZIP)结构域和3个未知功能结构域。CfHAC1基因敲除突变体的菌丝生长速度显著变慢,分生孢子产量显著减少且不能正常形成附着胞,并对山梨糖醇和KCl渗透压胁迫敏感性增加;致病力测试结果表明,果生刺盘孢菌基因敲除突变体ΔCfhac1对油茶的致病力显著下降。转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长、产孢、附着胞的形成、致病力以及响应外界渗透压胁迫过程。

果生刺盘孢CfHAC1调控应答二硫苏糖醇胁迫的转录组分析

果生刺盘孢Colletotrichum fructicola是油茶炭疽病优势病原菌。前期研究发现bZIP转录因子CfHac1参与调控该菌的生长发育和致病性。为了揭示转录因子CfHac1调控果生刺盘孢响应内质网压力和致病机理,本研究测定了ΔCfhac1突变体对内质网压力胁迫剂的敏感性,发现突变体对二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)的耐受性下降,说明CfHAC1基因可能参与调控果生刺盘孢响应内质网压力胁迫过程。进一步利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和CfHAC1敲除突变体菌株在DTT胁迫下的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2680个,其中上调表达基因有1181个,下调表达基因有1499个。Gene Ontology功能分析结果显示,差异表达基因主要参与催化活性、结合、代谢过程、细胞过程、细胞成分合成、生物过程调控和应激反应等生物学过程。KEGG功能富集分析表明,上调表达基因主要被富集到核糖体、真核细胞的核糖体生物合成、RNA转运和氰基氨基酸代谢通路中;下调表达基因显著富集在内质网蛋白质加工、N-聚糖生物合成、类固醇合成和蛋白质分泌等通路中。分析发现转录因子CfHac1调控内质网胁迫应答和致病相关基因的表达。本研究提供了在全基因组水平上对CfHAC1基因与内质网压力胁迫应答之间关联的新认识,为阐明果生刺盘孢响应内质网压力胁迫和致病机制奠定了基础。

组蛋白去乙酰化酶CfSnt2调控果生刺盘孢生长发育和致病力

炭疽病是油茶Camellia oleifera的重要病害,该病害的优势致病菌是刺盘孢属Colletotrichum的果生刺盘孢C.fructicola,在全国的油茶产区普遍发生。我们前期发现组蛋白乙酰转移酶CfGcn5调控油茶果生刺盘孢的生长发育和致病过程,但组蛋白去乙酰化酶在该病菌中的生物学功能尚不清楚。本研究以组蛋白去乙酰化酶CfSnt2为研究对象,利用反向遗传学的方法,通过对野生型、CfSNT2基因敲除突变体及互补菌株的生物学表型进行比较分析,发现CfSNT2基因敲除突变体的菌丝生长速率明显减缓、分生孢子的产量显著减少、附着胞形成率降低、对细胞壁胁迫剂的响应异常,同时对油茶致病力显著减弱。以上现象说明CfSnt2调控果生刺盘孢的生长、产孢、附着胞的形成、对细胞壁完整性胁迫剂的耐受性及致病力。