胎盘早剥产妇、新生儿血及脐血中组织因子和组织因子途径抑制物的变化

目的:检测胎盘早剥产妇血、新生儿血及脐血组织因子及组织因子途径抑制物蛋白的变化,以及这些变化对其凝血功能的影响。方法:收集2006-10/2007-04在中山大学附属第一医院产科的胎盘早剥产妇血(足月或早产不限)、分娩胎儿的脐带血及新生儿血标本各11例,4例为足月产,其余均为胎龄29～36周早产标本,男婴5份,女婴6份。正常对照15份来自同期广州市妇婴医院产妇及分娩胎儿。标本收集时间母亲血为分娩前24h内、脐血为分娩即刻、新生儿血为出生后2h内抽取,排除标准为产妇本次分娩前无血液系统疾病史,未使用过对凝血功能产生影响的药物,采用酶联免疫吸附方法测定血浆组织因子及组织因子途径抑制物抗原水平,并与正常分娩产妇对照组进行比较。病理及正常标本均经产妇及家属知情同意后获得。结果:①胎盘早剥产妇血、新生儿血及脐血血浆中组织因子测定值明显高于正常对照组(P<0.05)。②胎盘早剥产妇血、新生儿血浆及脐血中组织因子途径抑制物测定值较正常分娩产妇降低,差异具有显著性意义(P<0.01)。③胎盘早剥产妇血、新生儿和脐血组织因子途径抑制物/组织因子比值均较正常分娩产妇明显降低(P<0.01)。结论:胎盘早剥时产妇血、脐血及新生儿血促凝血活性增强,抗凝血活性降低,与其高凝状态相关。

人组织因子基因RNA干扰载体的构建与鉴定

目的构建人组织因子基因RNA干扰载体,为达到阻止凝血过程的启动打下基础。方法利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因(NM_001993)干扰片段,合成shRNA序列,再制备双链寡核苷酸(dsoligo),退火后形成的dsoligo双链克隆到pENTRTM/U6载体的粘性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒DNA小提、测序。将构建的载体转染到脐静脉内皮细胞,应用RT-PCR和免疫荧光验证载体对目的基因的干扰情况。结果测序证实阳性克隆为pENTRTM/U6-TF-shRNA,转染到脐静脉内皮细胞后组织因子的表达受到明显抑制。结论成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNA干扰载体,为研究组织因子基因RNA干扰载体在凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。

人组织因子基因RNAi载体pENTR^TM/U6-TF-shRNA的构建与鉴定

目的:RNAi效应与基因转移有密切关系。拟通过构建组织因子基因RNAi载体,为达到阻止凝血过程的启动打下基础。方法:实验于2006-11/2007-05在南方医科大学中医药学院中医症候实验室完成。利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因(NM_001993)干扰片段,合成shRNA序列,再行寡核苷酸双链的合成,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒感受态扩增,质粒DNA小提、测序。结果:合成的寡核苷酸双链退火处理后,经4%琼脂糖凝胶电泳,紫外观察可见ds oligo和ss oligo清晰可见,双链寡核苷酸与pENTRTM/U6的连接反应,转化到质粒感受态扩增后,提取得到的质粒DNA经过测序结果证实pENTRTM/U6-TF-shRNA为阳性克隆。结论:成功构建出凝血途径的人组织因子基因pENTRTM/U6-TF-shRNA载体,为研究组织因子基因RNAi载体在出凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞工具。

X线照射对宫颈癌HeLa细胞醛缩酶A表达和定位的影响

目的:观察宫颈癌HeLa细胞转染醛缩酶A(aldolase A,ALDOA)后,在X线作用下ALDOA在细胞内定位的改变,以及其对细胞存活率的影响。方法:克隆出ALDOA全长编码序列,构建真核表达质粒pECFP-C1-ALDOA,实验组通过脂质体介导将pECFP-C1-ALDOA转染HeLa细胞,设载体pECFP-C1作为阴性对照,各组均给予X线照射,荧光显微镜观察照射前后HeLa细胞中pECFP-C1-ALDOA和pECFP-C1表达及定位的变化,用XTT法检测细胞存活率的改变。结果:双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;荧光显微镜下观察HeLa细胞内pECFP-C1-ALDOA主要分布于胞浆,pECFP-C1为全细胞均匀分布;经X线照射24h后胞浆中的pECFP-C1-ALDOA逐渐转至胞核,而pECFP-C1在细胞内的定位则不发生明显改变;经XTT法检测,发现X线照射后,转染pECFP-C1-ALDOA质粒的细胞存活率明显高于转染pECFP-C1的对照组细胞。结论:抑制ALDOA的表达,可使X线更易诱导宫颈癌细胞的死亡,因此其可能作为宫颈癌放射治疗的新靶点。

RNA干扰人脐静脉血管内皮细胞组织因子基因表达

目的利用RNA干扰技术沉默脐静脉内皮细胞中组织因子基因,实现瞬时沉默,为进行组织因子(TF)表达干扰的体内试验进行探索。方法设立3种处理方法:①空白未干扰;②假干扰;③RNA干扰,每种实验方法各有3个样本。将合成的人组织因子基因(NM_001993)干扰片段shRNA序列,扩增、提取、测序正确后,转染至人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),分别对3种处理方法后TF基因沉默前后mRNA的表达采用Gel-Pro Analyzer软件进行区带灰度值扫描并分析、TF蛋白水平的表达采用免疫荧光检查进行观察。结果shRNA转染到HUVECs后TFmRNA的表达处理间差异显著,F=27.657,P=0.001,未干扰和假干扰之间没有显著性差异(P=0.103,>0.05),未干扰和干扰之间(P=0.000,<0.05)有显著性差异。空白未干扰TF免疫荧光检测呈现"满天星"的表现,在阴性对照组荧光染色略有减少,在RNA干扰组TF蛋白表达明显减少。结论HUVECs中TF的表达被所构建的pENTRTM/U6-TF-shRNA载体明显抑制,有可能成为未来出凝血及其它疾病的新的治疗手段之一。