基于ROS/TXNIP/NLRP3通路探讨槲皮素对Pg-LPS诱导RAW264.7细胞炎症因子表达的影响

目的探讨槲皮素调控活性氧(ROS)/硫氧还蛋白结合蛋白(TXNIP)/NOD样受体相关蛋白3(NLRP3)信号通路对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)诱导RAW264.7细胞炎症因子的影响。方法采用1 mg/L Pg-LPS刺激RAW264.7巨噬细胞构建细胞炎症模型,分为对照组、模型组及槲皮素低、中、高剂量组(5、25、50μmol/L),MTT法检测细胞活力,倒置显微镜观察各组细胞形态变化,RT-qPCR法检测炎症因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β、TNF-α、诱导型NO合酶(iNOS)、环氧合酶(COX-2)mRNA表达,荧光分光光度计检测细胞中ROS水平,Western blot法检测TXNIP、NLRP3蛋白表达。结果0~50μmol/L槲皮素对RAW264.7细胞活力无明显影响(P>0.05)。与对照组比较,模型组细胞形成伪足所占比例升高(P<0.05),IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2 mRNA及TXNIP、NLRP3蛋白表达上调(P<0.05),ROS水平增加(P<0.05);与模型组比较,槲皮素各剂量组细胞形成伪足所占比例降低(P<0.05),IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2 mRNA及TXNIP、NLRP3蛋白表达下调(P<0.05),ROS水平减少(P<0.05),并呈剂量依赖性。结论槲皮素可抑制Pg-LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达,其机制可能与抑制ROS/TXNIP/NLRP3信号通路活性有关。

miR-124所修饰rDPSCs来源外泌体对巨噬细胞极化的影响研究

目的探讨miR-124修饰的大鼠牙髓干细胞(rDPSCs)来源外泌体对巨噬细胞极化的影响。方法从SD大鼠牙髓中分离出rDPSCs,流式细胞术鉴定rDPSCs表面标志物CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD146的阳性比率;油红O染色、茜素红S染色观察rDPSCs成脂成骨能力。利用细胞转染技术将miR-124模拟物(miR-124 mimics)及其阴性对照(miR-NC)转染于rDPSCs,分组为空白组、miR-NC组、miR-124组,并提取转染后rDPSCs的外泌体,分别命名为Exosome组(Exo组)、Exo/miR-NC组、Exo/miR-124组,透射电镜观察外泌体形态;Western blot检测外泌体标志蛋白CD63和CD81表达水平;qRT-PCR检测rDPSCs及rDPSCs外泌体中miR-124表达水平。将25只大鼠随机分为sham组、model组、rDPSCs Exo组、rDPSCs Exo/miR-NC组和rDPSCs Exo/miR-124组,每组5只,构建皮肤缺损模型,分别于皮肤缺损相应区域注射30μl对应的外泌体进行干预,qRT-PCR检测大鼠创伤组织中miR-124表达水平;ELISA法检测大鼠血清中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、甘露糖受体(CD206)含量;Western blot检测大鼠创伤组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-1β、白细胞介素(IL)-6、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表达。结果rDPSCs表面标志物CD14、CD34、CD45的阳性比率均低于CD90、CD105、CD146;rDPSCs具有成骨成脂能力;透射电镜可观察到外泌体为大小均一,直径50~100 nm,呈圆形或椭圆形的囊泡结构;CD63和CD81蛋白在rDPSCs外泌体中高表达;与空白组和miR-NC组比较,miR-124组rDPSCs中miR-124表达水平显著升高,且Exo/miR-124组rDPSCs外泌体中miR-124表达水平显著高于Exo组和Exo/miR-NC组(P<0.05);与sham组比较,model组大鼠血清中iNOS含量、创伤组织中TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表达显著升高,CD206含量、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表达显著降低(P<0.05);与rDPSCs Exo组和rDPSCs Exo/miR-NC组比较,rDPSCs Exo/miR-124组中iNOS含量、TNF-α、TNF-1β、IL-6蛋白表达显著降低,CD206含量、IL-4、IL-10、IL-13蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论miR-124过表达修饰的rDPSCs外泌体可通过抑制M1型巨噬细胞极化、促进M2型巨噬细胞极化来调控炎性反应。