蛋白激酶G介导烧伤休克后内皮细胞骨架的变化

目的 :探讨蛋白激酶G(PKG)在烧伤休克发病机制中的作用。方法 :用 10 %人烧伤血清刺激培养的内皮细胞后 ,通过细胞裂解和离心获得细胞裂解液 ,用放射性同位素法测定PKG的活性。同时采用特异性荧光染色法检测细胞内肌动蛋白微丝 (F -actin)的结构和分布变化。用PKG特异性抑制剂KT5 82 3预处理细胞后 ,再检测烧伤血清介导的细胞内PKG活性和F -actin的变化。以空白组为阴性对照 ,以PKG激动剂 8-Br -cGMP刺激细胞作为阳性对照组。结果 :人烧伤血清和PKG的激动剂 8-Br -cGMP都可以时间依赖性地激活内皮细胞的PKG ,并且诱导细胞内F -actin呈极性分布。KT5 82 3预处理则明显抑制了这种变化。结论 :烧伤血清可以介导血管内皮细胞PKG的激活和F -actin的应力性变化 ;烧伤休克时的血管通透性升高与PKG的活性变化密切正相关 。

三七总皂甙增强人内皮源性一氧化氮合酶基因启动子活性

目的探讨三七总皂甙(tPNS)对人内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)基因启动子转录活性的调控机制。方法以基因重组技术构建人eNOS基因启动子区(-1~ -1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc,采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和β-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-β共转染NIH3T3细胞,用细菌脂多糖(LPS)、tPNS和转移生长因子β1(TGFβ1)等因子分别刺激转染后的NIH3T3细胞,检测并比较荧光素酶/β-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、tPNS和TGFβ1对人eNOS基因启动子转录活性的影响。结果(1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在NIH3T3细胞中有效表达;(3)在LPS刺激下,人eNOS启动子的转录活性降低,而在tPNS和TGFβ1刺激下,其启动子的转录活性增强,其中,TGFβ1较tPNS所致的转录活性更强。结论正确构建了人eNOS基因启动子区(-1^-1 600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体peNOS-Luc;tPNS在NIH3T3细胞中增强人eNOS基因启动子的转录活性。

衰老和低氧对体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞形态的影响

目的:探讨衰老及低氧对体外培养的PASMCs形态的影响。方法:将细胞分为年轻常氧组、老年常氧组、年轻低氧组、老年低氧组,应用光镜观察、免疫组化及免疫荧光的方法检查细胞的形态变化。结果:低氧状态与常氧条件下培养的PASMCs形态上有明显差别,且胞浆内F-actin分布及排列均有明显差别;老年组PASMCs的SM-α-actin含量减少比年轻组明显;低氧组PASMCs的SM-α-actin含量比常氧组减少明显。结论:衰老及低氧使PASMCs形态发生变化,均能直接刺激PASMCs的转化;衰老的平滑肌细胞受低氧刺激,SM-α-actin变化最为明显。

甲酰化肽样受体介导脂多糖诱导的白细胞趋化反应及虎杖甙的调节作用研究

目的:初步研究虎杖甙(PD)对脂多糖刺激下白细胞趋化活性调节的机制。方法:用趋化小室方法测定虎杖甙对LPS刺激下多形核白细胞(PMN)趋化活性及转染了甲酰化肽样受体(FPRL1)基因的293细胞(FPRL1/293)趋化活性的影响。结果:LPS及LPS刺激的PMN上清可增强多形核白细胞的趋化反应;同样LPS刺激下转染了甲酰化肽样受体基因的293细胞的趋化性显著升高。而PD可下调LPS刺激引起的PMN和FPRL1/293细胞的趋化性升高。结论:甲酰化肽样受体FPRL1可能参与介导脂多糖引起的白细胞趋化反应,PD可能通过抑制白细胞趋化因子的分泌和下调甲酰化肽样受体活性来调节细胞的趋化性。

RFP-AWP1原核表达载体的构建及表达特性研究

目的:建立红RFP-AWP1融合基因的原核表达载体,研究其表达蛋白特性。方法:将克隆的人AWP1(associated with protein kinase Crelated kinase 1,AWP1)和水母的红色荧光蛋白(redfluorescence protein,RFP)的cD-NA插入到原核表达载体pET-17b的多克隆位点(mutiple clone sites,MCS)中,经AWP1 cDNA的PCR鉴定和E.coli DE3中的表达鉴定后,E.coli DE3表达AWP1-RFP融合蛋白,荧光显微镜观察其表达特性及与GST-beads的pull-down实验。结果:成功构建了载体pET-AWP1-DsRed1,在大肠杆菌中获得了高效表达的AWP1-RFP融合蛋白,其活菌液在荧光显微镜下呈火山熔岩状的亮红色,干固的细菌呈斑片状红色荧光;AWP1-RFP融合蛋白可与GST-beads结合,并在激发波长为508nm的条件下呈红色荧光,而在波长为488 nm激发光条件下可见橙黄色荧光。结论:在体外验证了AWP1-RFP融合蛋白具有可视性表达的特点,同时发现其能与GST-beads结合,为pull-down AWP1及其相关蛋白提供了一条新途径,为研究AWP1-RFP融合蛋白在真核细胞中的表达、定位及蛋白-蛋白相互作用等具有指导意义。

肠上皮通透性变化及其在烧伤休克发病中的作用

肠上皮通透性,关系到正常状态下营养物质的吸收和病理情况下肠道有害物质的入血,因此研究其变化机制具有重要意义.