刚地弓形虫入侵宿主细胞过程中棒状体蛋白16的分泌与分布

目的观察刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)不同毒力株的棒状体蛋白16(ROP16)在入侵宿主细胞过程中的分泌及分布。方法以刚地弓形虫RH株速殖子c DNA为模板,PCR扩增Tgrop16基因,克隆至p ET-32a(+)载体,在大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组蛋白Tg ROP16经纯化后免疫新西兰大白兔,制备抗Tg ROP16多克隆抗体,用蛋白质印迹(Western blotting)和间接ELISA检测抗Tg ROP16多克隆抗体的特异性和敏感性。用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测刚地弓形虫RH株和Pru株速殖子Tgrop16基因的转录水平,Western blotting分析RH株和Pru株Tg ROP16蛋白的表达量。用间接免疫荧光(IFA)检测弓形虫RH株和Pru株速殖子在入侵人包皮成纤维细胞(HFFs细胞)过程中,Tg ROP16蛋白在宿主细胞中的分泌与分布。结果制备的抗Tg ROP16多克隆抗体,Western blotting分析结果显示,能与重组蛋白Tg ROP16结合,在相对分子质量(Mr)约100 000处有一特异性条带;间接ELISA检测结果显示,抗体效价为1∶25 600。实时荧光定量PCR检测结果显示,Pru株Tgrop16基因表达量(7.786±0.206)是RH株(1.000±0.110)的7倍(P<0.05)。Western blotting分析结果显示,RH株中Tg ROP16蛋白表达量(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.373)较高于Pru株(Tg ROP16与其内参Tg Tubulin的灰度比值为0.232)。IFA检测结果显示,RH株和Pru株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白定位于速殖子的顶端复合体,速殖子入侵HFFs细胞后,Tg ROP16蛋白显示在虫体外。结论制备的抗Tg ROP16多克隆抗体特异性和敏感性高;刚地弓形虫RH株速殖子的Tg ROP16蛋白表达量高于Pru株的;两株速殖子在入侵HFFs细胞前,Tg ROP16蛋白分布于速殖子顶端复合体,在入侵宿主细胞过程中被分泌出虫体。