耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型的建立

＂超级细菌＂耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）是诱发连续腹膜透析患者腹膜炎的常见细菌,且治疗困难。目前缺少MRSA腹膜炎动物模型。腹腔注射2×10^9-2×10^10CFU/mL 7组不同浓度的MRSA感染小鼠,观察小鼠死亡时间,测定肝脏与脾脏细菌定植量,进行肝、脾病理分析,确定适宜的建模浓度。研究发现,小鼠感染细菌浓度最小致死剂量为每只2×10^9CFU,最适建模浓度为每只1.4×10^9CFU。结果表明建立了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型,为MRSA致腹膜炎的致病机制研究、疫苗的研制提供实验基础。

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

目的利用Red重组系统构建肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7 ppk基因缺失株,并研究其生物特性。方法设计并合成一对同源臂引物,每条引物5'端与ppk基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗性基因片段;制备含有pKD46质粒的EHEC O157:H7 EDL933w感受态细菌,然后将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中;利用pKD46介导的Red重组系统,通过同源重组替换EHEC O157:H7 EDL933w ppk基因,PCR和测序验证;通过革兰染色、测D600值、吉姆萨染色比较EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的形态结构、生长能力和黏附性。结果构建了ppk基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株(EHEC O157:H7 EDL933wΔppk),初步探索了EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的生物学特性。结论本研究运用Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中ppk基因的调控机制奠定了基础。

肠出血型大肠埃希菌O157:H7 espF基因缺失株和回补株的构建

目的利用Red同源重组系统敲除肠出血型大肠埃希菌的esp F基因及其核苷酸片段;建立以p BAD 33质粒为载体的esp F基因回补实验平台。方法设计1对同源臂引物扩增卡那霉素抗性打靶片段,将抗性打靶片段电转入含有PKD46质粒的EDL933w,在PKD 46介导的重组系统帮助下,打靶片段和菌体esp F基因发生同源重组,PCR和测序验证;PCR扩增esp F及其核苷酸片段的整个ORF区序列,将其克隆入p BAD33质粒,分别将重组质粒转入相应的缺失株,以构建出相应的回补突变株。采用RT-PCR的方法验证在相应的回补突变株中esp F及其核苷酸片段是否转录。结果构建了esp F基因及其核苷酸片段缺失的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株和相应的回补株,且esp F基因及其核苷酸片段在回补株中均发生转录。结论本研究运用Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 esp F基因缺失株,并建立以p BAD33质粒为载体的EHEC O157:H7基因回补方法,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中esp F基因的调控机制奠定了基础。

A型肉毒毒素(BoNT/A)表位多肽单克隆抗体的制备及其效价评定

目的获得高效价A型肉毒毒素（BoNT／A）表位多肽单克隆抗体。方法利用DNASTAR分析软件，结合Expasy网络服务器，综合参考多参数预测B细胞抗原表位；以多肽作为抗原制备BoNT／AHc表位多肽单克隆抗体，并进行效价鉴定。结果以合成多肽（P1＆P2）分别免疫Balb／c小鼠，获得两株单克隆抗体，经鉴定分别是IgG和IgM，效价为10-5～10-6；检测抗体结果显示，纯度较高，特异性好。结论本研究制备出了特异性好、效价较高的A型肉毒毒素单克隆抗体，为获得抗A型肉毒毒素的快速现场检测提供技术支持。