深圳市基于污水流行病学的新型冠状病毒奥密克戎变异株感染者来源追踪案例分析

污水流行病学(WBE)是一门新兴学科,已被应用于药物滥用追踪和传染病病原体监测。在新型冠状病毒(简称新冠病毒)感染疫情期间,WBE被应用于监测疫情流行趋势和提供早期预警。为了及时发现隐匿的新冠病毒感染者,防止其在社区的传播,深圳市于2022年7月26日至11月30日在福田、南山、罗湖和盐田区的口岸地带、城中村、居民小区等重点场所布设369个污水采样点位,覆盖193万人口,开展污水监测新冠病毒的工作。每日在用水高峰时段进行3 h连续采样,采用聚乙二醇沉淀法和RT-qPCR进行污水病毒富集浓缩及新冠病毒核酸检测,并形成了阳性水样处置流程。本文旨在介绍深圳市基于城市污水开展新冠病毒感染者来源追踪的相关案例,在罗湖区洪湖水质净化厂污水监测有效发挥了早期预警作用并实现感染者来源追踪;在福田区福田南路阳性水样处置中获得监测点位布设的重要经验;在南山区南山村污水监测中揭示了隐匿感染者的存在。分享基于WBE的新冠病毒监测和感染者追踪,避免新冠病毒感染者在社区传播的经验,总结污水监测的优势和应用前景,为未来具有肠道排毒的新发或再发传染病病原体监测提供新的研究思路。

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白EspF与宿主膜联蛋白A6(ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA(single guide RNA,sgRNA),基于LentiCRISPRv2载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力无明显影响;免疫荧光结果显示,Caco-2及Caco-2anxa6‒/‒细胞紧密连接蛋白ZO-1均沿细胞膜连续分布,结构完整,转染EspF质粒后出现分布不完整、缺口等现象。【结论】成功构建anxa6基因稳定敲除的Caco-2细胞株,初步探索ANXA6蛋白在紧密连接分布中的作用,为进一步研究大肠杆菌O157:H7通过EspF-ANXA6互作介导宿主肠屏障损伤分子机制提供技术支撑。