表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌杀蚊幼活性及增效剂型测试

目的构建表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌,检测重组菌对致倦库蚊和白纹伊蚊II龄幼虫的毒力,并测试不同剂型的增效作用。方法分别将AaIT和Cyt2Ba编码基因克隆于pET28a(+)质粒上,并将重组质粒分别转化BL21 E.coli获得分别表达AaIT和Cyt2Ba的工程菌株,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白的表达;测试不同浓度工程菌菌液对于蚊幼虫的杀灭效果;并将有效的工程菌制成干粉剂,检测其干粉末及其配剂对蚊幼虫的杀灭效果。结果 AaIT和Cyt2Ba重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,但AaIT重组蛋白对蚊幼虫不具有毒性。表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌菌液对白纹伊蚊和致倦库蚊幼虫均具有明显的杀灭作用,48 h的LC50分别为3.00×106和1.25×107cells/m L,其中对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果要显著优于对致倦库蚊幼虫的杀灭效果(P<0.001),并且表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌干粉末及其配剂均具有较好的杀蚊幼虫效果。当该工程菌干粉末与干酵母粉、小麦粉和白胡椒粉分别按4∶1、1∶1和1∶4比例制成配剂处理蚊幼虫48 h后,结果显示当质量比为1:1时,配剂杀蚊幼效果显著提高(P=0.044),并且白胡椒粉末配剂效果要显著好于干酵母粉和小麦粉配剂(P=0.002)。结论表达Cyt2Ba的重组大肠埃希菌对蚊幼虫具有较好的杀灭作用,合适配剂的使用可以增强其在蚊虫防制中的效果。

应用改良凝集试验(MAT)法检测东北地区野生鸟类弓形虫感染的血清学调查

目的了解中国东北地区野生鸟类的弓形虫感染情况。方法在对东北地区野生鸟类进行调查时,从翼根静脉采集约500μL全血,凝血后分别分离出血清,采用改良凝集试验(MAT)方法检测血清中弓形虫抗体的阳性率。结果共收集到179份野生鸟类血清样本,其中弓形虫阳性血清样本20份,总的血清阳性率约为11.17%。179只野生鸟隶属于9目17科31种,其中鸽形目、雀形目、隼形目、鴷形目、佛法僧目、雁形目的血清阳性率分别为5.26%(1/19),9.09%(9/99),14.29%(3/21),15.00%(5/22),16.67%(1/6),和25.00%(1/4)。按不同食性分类,肉食性、杂食性或水生动植物为食的鸟类的血清阳性率分别为12.00%(3/25),10.60%(15/141),15.38%(2/13)。按照鸟类是否迁徙分类,候鸟和留鸟的血清阳性率分别为11.67%(14/120),10.71%(6/59)。结论东北地区的野生鸟类中弓形虫抗体的阳性率约为11.17%,显示弓形虫感染现象常见于野生鸟类。

登革热诊疗的最新研究进展

登革病毒(dengue virus, DENV)从受感染的伊蚊传播给人类,会引发轻度(登革热)至致命性疾病(登革休克综合征)。不同DENV血清型或不同黄病毒之间相似的保守结构和序列导致了交叉反应的发生,进而产生抗体依赖性增强效应。此外,黄病毒的交叉反应性可能在临床中出现对登革热的误诊,从而影响治疗。因此,需要具有高特异性和敏感性的诊断方法,为DENV感染者提供早期诊断和治疗。目前,仍缺乏能够对不同DENV血清型感染提供有效保护的疫苗,故深入研究以开发有效的治疗药物至关重要。本文旨在对登革热诊断及治疗的最新进展进行综述。

弓形虫抑制γ干扰素依赖的宿主细胞免疫的研究进展

近年来的研究表明,弓形虫感染小鼠细胞后,分泌的毒力蛋白——棒状体蛋白18(ROP18)能与免疫相关GTP酶(IRG)结合并使其发生磷酸化,致使IRG不能结合至纳虫泡膜上,纳虫泡不发生破裂,弓形虫得以在纳虫泡中生长增殖。此为弓形虫在小鼠细胞内实现免疫逃避的机制,但是弓形虫感染人细胞后的免疫逃避机制尚未明了。据报道,人细胞中泛素标记的纳虫泡能与内溶酶体系统融合,最终导致弓形虫因酸化而死亡。为此,本文综述了近年来弓形虫抑制宿主免疫功能,尤其是γ干扰素依赖的细胞免疫,以及弓形虫通过阻断泛素标记纳虫泡膜进而成功实现免疫逃避的研究进展。

CHIKV Real-time PCR检测方法的建立及试剂盒研发

目的建立快速特异检测基孔肯雅病毒的Real-time PCR方法及试剂盒。方法根据发表在Genbank上15株基孔肯雅病毒基因序列全长,应用Clustal W2.0和DNAMAN8软件筛选出位于其E1基因上的种内保守种间特异的目的片段,并据此设计出最优引物。人工合成该基因片段并构建重组质粒,对重组质粒梯度稀释后,再利用SYBR GreenI Real-time PCR的方法检测该特异基因的浓度,建立标准品曲线,用于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,标准品的PCR扩增产物的电泳条带长度与目标条带一致,测序结果显示与目标条带序列一致,说明引物与阳性质粒性能良好。经优化确定CHIKV荧光定量PCR反应体系中最佳的引物浓度为350 nmol/L,最佳的反应条件为:50℃2 min;95℃预变性2 min;以95℃15 s,60℃15 s,72℃1 min进行40个循环扩增,在72℃进行荧光采集。根据荧光定量PCR熔解曲线出现特异性单峰,并对黄病毒属成员登革病毒和寨卡病毒的检测为阴性,表明该检测方法特异性高;检测阈值达302拷贝,显示敏感性好,重复试验的变异系数均小于0.1%,说明该实验设计稳定性良好。结论基于该方法的试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、能够快速定量等优点,有利于临床上基孔肯雅病毒的早期诊断,具有良好的应用前景。

弓形虫慢性感染小鼠脑转录组分析及与抑郁相关的犬尿氨酸通路的验证

目的筛选并分析刚地弓形虫慢性感染小鼠脑转录组差异表达基因(DEG),分析与抑郁相关的犬尿氨酸(KYN)通路DEG的相对转录水平,为探究弓形虫慢性感染导致小鼠抑郁样症状的机制提供理论依据。方法18只SV129雄性小鼠随机平均分为感染组和对照组。感染组小鼠腹腔注射ME49株速殖子120个(200μl),对照组注射等体积的磷酸缓冲液,感染后3个月收集感染组和对照组小鼠脑组织,提取小鼠脑组织总RNA进行转录组测序,筛选DEG,对DEG进行聚类分析、基因本体(GO)功能注释分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析。选取与抑郁症相关的KYN通路的8个DEG,分别为γ干扰素(IFN⁃γ)、吲哚胺2,3⁃双加氧酶1(IDO1)、IDO2、犬尿氨酸酶(KYNU)、犬尿氨酸⁃3⁃单氧化酶(KMO)、3⁃羟基邻氨基苯甲酸3,4⁃二加氧酶(3⁃HAO)、波形蛋白(Vim)和脑源性神经营养因子(BDNF),以甘油醛⁃3⁃磷酸脱氢酶基因为内参,实时荧光定量PCR(qRT⁃PCR)检测各个基因的相对转录水平。结果感染组和对照组小鼠脑转录组的DEG共2295个,其中上调2016个,下调279个。GO分析结果显示,生物过程中富集最显著的是定位,共257个DEG;细胞组分中富集最显著的是蛋白复合物,共425个DEG;分子功能中富集最显著的是分子转导活性,共177个DEG。生物过程、细胞组分和分子功能富集DEG数量最多的分别是细胞过程、细胞组分和结合,分别有1039、1240、1088个DEG。KEGG分析结果显示,功能注释分析上调居前3位的代谢通路分别为免疫系统、信号转导、病毒性传染病,下调居前3位的分别为信号转导、信号分子和相互作用、免疫系统;功能富集分析结果显示77条通路富集显著。与抑郁症相关的信号通路有肿瘤坏死因子、神经活性配体⁃受体相互作用、NF⁃kappa B、JAK⁃STAT、坏死性凋亡、细胞凋亡、趋化因子、KYN通路等。qRT⁃PCR结果显示,以对照组小鼠相对转录水平为100%,感染组小鼠IFN⁃γ、IDO1、IDO2、KYNU、KMO、3⁃HAO和Vim等7个基因的相对转录水平分别为3023.08%、355.52%、190.17%、496.55%、339.92%、212.74%、507.34%,较对照组的转录水平显著上调(t=3.782、3.749、3.226、2.908、2.533、5.656、2.948,均P<0.05或0.01);BDNF的相对转录水平为63.32%,转录水平显著下调(t=2.398,P<0.05)。IFN⁃γ、IDO1、IDO2、KYNU、KMO、3⁃HAO、BDNF、Vim等8个基因qRT⁃PCR获得的差异倍数分别为4.96、1.74、0.89、2.10、1.60、1.06、-0.94、2.18,转录组测序获得的差异倍数分别为7.30、0.55、0.80、3.83、2.75、3.53、-0.86、1.93。qRT⁃PCR与转录组测序获得的转录趋势一致。结论筛选获得刚地弓形虫慢性感染小鼠脑转录组DEG,弓形虫慢性感染小鼠中枢神经系统免疫持续激活,与抑郁症相关的KYN通路的7个DEG的转录水平上调。

弓形虫感染后宿主细胞泛素化蛋白谱变化的特征分析

目的探究刚地弓形虫不同毒力虫株感染后宿主细胞泛素化蛋白谱变化的特点。方法将人外周血单核细胞诱导成巨噬细胞后分为3组,分别为未感染组、RH感染组、ME49感染组。2个感染组分别用弓形虫不同毒力株(RH株与ME49株)速殖子感染4 h后,收集3组细胞的总蛋白,应用泛素抗体富集泛素化蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白后进行蛋白定性质谱鉴定。检测完成后,搜索UniProt数据库中的人类数据库,利用Mascot鉴定蛋白质种类。蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析蛋白CDC42的泛素化水平。利用DAVID数据库对感染组与对照组、不同毒力株感染组之间的显著差异性泛素化蛋白(DUP)进行基因本体(GO)注释和富集分析,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)在线网站对DUP进行信号通路富集分析,利用STRING 11.0在线网站对DUP进行蛋白-蛋白相互作用网络分析。结果质谱筛选结果显示,RH感染组的特异性泛素化蛋白有194种,ME49感染组的有47种,两个感染组均筛选到的宿主泛素化蛋白有31种。Western blotting检测结果显示,宿主CDC42在弓形虫感染后泛素化水平显著升高。GO聚类分析显示,细胞组分聚类中,RH感染组的DUP主要涉及能量代谢以及蛋白质合成、加工的细胞器,有67个蛋白;ME49感染组的DUP则主要涉及细胞骨架结构,有11个蛋白;在生物进程聚类中两组差异不大,不同的是,ME49感染组的DUP富集到肝配蛋白受体信号通路(3个)和网格蛋白介导的内吞作用蛋白(2个);在分子功能聚类中,RH感染组的DUP主要富集在与RNA转录/加工、GTPase活性、泛素连接酶相关的聚类项,分别有47、7和11个蛋白;ME49感染组的DUP则主要富集在肌动蛋白丝结合(3个)等GO项上。KEGG信号通路富集显示,RH感染组的DUP主要富集在核糖体(12个)、泛素介导的蛋白水解(8个)、吞噬体(7个)、核苷酸切除修复(4个)、致病性大肠埃希菌感染(4个)等通路;ME49感染组的DUP则富集在核糖体(3个)、肌动蛋白细胞骨架调节(3个)和致病性大肠埃希菌感染(2个)的通路上。RH感染组DUP相互作用网络图主要的节点蛋白包括60S核糖体蛋白L9、蛋白质转运蛋白SEC61亚单位α亚型1以及RAS相关C3肉毒毒素底物1等。RH感染组与ME49感染组共有泛素化蛋白的相互作用网络图主要节点蛋白则有核糖体蛋白以及细胞分裂周期蛋白42等。结论弓形虫感染引起宿主细胞的泛素化蛋白谱发生显著变化,与感染虫株的毒力相关;DUP包括细胞骨架、核糖体、泛素蛋白酶体途径的主要蛋白。

刚地弓形虫抗缓殖子期抗原1单克隆抗体的制备与应用

目的 制备弓形虫抗缓殖子期抗原1 (BAG1)的单克隆抗体,探究其在弓形虫缓殖子鉴定上的应用。方法分别收集碱性培养基(pH 8.2)诱导5 d后的弓形虫ME49虫株(体外诱导)和慢性感染后2个月的小鼠脑组织匀浆中的ME49虫株(体内形成)。提取体外诱导的弓形虫ME49虫株缓殖子总RNA, RT-PCR扩增bag1开放读码框片段,亚克隆至原核表达载体pET-28a (+),转化至BL21 (DE3)大肠埃希菌,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达BAG1,采用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白BAG1表达情况。取6只BALB/c小鼠,皮下注射纯化的重组BAG1蛋白(20μg/鼠) 3次后(首次免疫用弗氏完全佐剂,后两次免疫用等量弗氏不完全佐剂,每隔2周免疫1次),选择血清抗体效价高的小鼠,取脾组织分离脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,用纯化的BAG1蛋白经间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经多次亚克隆筛选稳定分泌抗BAG1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,收集培养上清,间接ELISA法检测抗体效价和抗体亚型。取BALB/c小鼠4只,液体石蜡腹腔注射(0.5 ml/鼠) 1周后,腹腔注射单克隆杂交瘤细胞106个/鼠,2周后收集腹水,亲和色谱法纯化抗BAG1的单克隆抗体。制备体外诱导和体内形成的弓形虫裂解蛋白,以纯化后的抗BAG1单克隆抗体为一抗,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测ME49虫株中BAG1蛋白的表达情况,间接免疫荧光试验(IFA)检测ME49虫株缓殖子情况。结果RT-PCR扩增获得bag1的开放读码框片段,长690 bp,编码229个氨基酸。重组质粒pET-28a (+)-bag1经菌落PCR和测序后鉴定正确。SDS-PAGE结果显示,重组BAG1蛋白相对分子质量(Mr)约为27 000,以可溶性蛋白和包涵体形式表达。间接ELISA检测结果显示,纯化的BAG1蛋白免疫小鼠3次后,血清抗体平均效价可达1∶102 400。融合筛选获得4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为mAb1H03、 mAb4B04、 mAb5H07、 mAb8B12,以mAb4B04单克隆抗体效价最高,达1∶25 600,该抗体亚型为IgG1型。Western blotting结果显示,mAb4B04单克隆抗体可识别体外诱导和体内形成的ME49虫株BAG1蛋白。IFA结果显示,mAb4B04单克隆抗体可检测到体外诱导和体内形成的ME49虫株缓殖子。结论 制备了抗弓形虫BAG1的单克隆抗体,其中效价最高的mAb4B04单克隆抗体能特异性识别弓形虫ME49虫株的BAG1蛋白和缓殖子。