大肠杆菌O157:H7体内多聚磷酸盐的DAPI荧光定量检测

目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐(polyP)的可靠方法。方法提取并纯化大肠杆菌O157:H7野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80℃速冻溶解、-20℃速冻溶解、60℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1两个突变株polyP含量。结果应用360 nm激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm激发波长,DAPI-polyP最大发射波长为550 nm;应用405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光(425～475 nm),应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光(500～560 nm);最佳细菌前处理方法为-80℃速冻后室温下自然溶解;标准曲线为Y=1849X+127.5(R2=0.991),测定各株菌polyP量,其中野生株显著高于ppk1缺失突变株。结论 DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点,可为进一步研究polyP在肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持。