Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因重编程人皮肤成纤维细胞的实验研究

目的探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因能否将人皮肤成纤维细胞(HSF)编程为诱导性多潜能干细胞(iPS)。方法①利用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞。②包装生产携带Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因的逆转录病毒上清液感染HSF细胞。③病毒感染后HSF细胞培养,镜下观察HSF细胞形态学变化。④应用细胞碱性磷酸酶(AP)染色检测细胞基因表达量和体内分化畸胎瘤实验对细胞生物学特性进行鉴定。结果原代HSF细胞编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,细胞体内可分化为畸胎瘤。结论利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因可将HSF细胞编程为iPS细胞。

免疫抑制剂治疗百草枯中毒的Meta分析

目的探讨免疫抑制剂对百草枯的治疗效果。方法检索国内外1970年1月～2008年6月公开发表的免疫抑制剂治疗百草枯中毒的相关论文,包括观察性研究和随机对照试验(RCT),提取观察性研究的生存率及可信区间,对照研究的风险比(RR)为效应量进行异质性检验和统计量合计分析。结果共计8项研究入选,6项历史对照性研究,2项随机对照研究。免疫抑制剂对百草枯中毒的预后有显著改善[历史对照的观察性研究RR为0.56(95%CI=0.45～0.69)和RCT研究RR为0.76(95%CI=0.62～0.94)]。结论免疫抑制剂治疗对百草枯中毒的生存率改善明显。但目前文献存在明显异质性,证据尚不够充分,需要进行更多的RCT试验以进一步明确。

体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞

目的探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞(UMC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)的方法。方法用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶和0.25%胰蛋白酶消化法原代分离培养UMC细胞,用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞,镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果脐带组织分离培养第3天,有少量UMC贴壁生长,细胞膜周围有折光性,形态类似于成纤维细胞;皮肤组织块贴壁培养第7天,有HSF爬出,呈长梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长,UMC和HSF数量逐渐增多,细胞生长状态良好。结论应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培养出UMC和HSF。

供体特异性体内免疫状态的定量检测

背景:由于免疫反应的复杂性,目前的免疫学检测方法均有其局限性,虽然各种检测技术精确程度不断提高,但是单一指标不足以判断机体复杂的免疫状态。建立一种在多指标基础上的联合评估模式来监测移植后受体免疫状态是当前需要解决的难题。目的:建立具有供体抗原特异性的体内免疫状态定量检测方法,探索该方法的流式检测技术参数、荧光染色条件、输注细胞数及确定最佳测试时间点。方法:取C57及BALB/c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色后制备1∶1混合细胞悬液,按混合细胞输注C57→BALB/c小鼠皮肤移植排斥模型,分别于输注后1,2,4,10h,1,2,3,6d应用流式细胞仪检测外周血两种荧光细胞的比例变化,同时设未移植BALB/c小鼠为对照,探索CFSE荧光染色条件、输注细胞数及确定最佳测试时间点,按公式计算供体特异性细胞杀伤率。结果与结论:供体特异性体内免疫状态定量检测方法流式检测设定在淋巴细胞门,两种细胞CFSE的染色浓度差控制在20倍左右,输注细胞总数在一定范围内对结果没有影响,输注细胞后2～4h为最佳检测时间点。提示体内细胞毒性试验是一种简单、准确、稳定的免疫状态体内定量监测方法,可以全面反映小鼠皮肤移植后受体的免疫状态。

旋转生物反应器内微载体大规模扩增肝细胞

目的评估旋转生物反应器(RCCS)内肝细胞微载体大规模培养的可行性。方法为获取足够数量活性良好的肝细胞种子细胞,本实验探索在RCCS内应用微载体技术快速扩增肝细胞的方法。将CL-1细胞和HepFMMU应用Cytodex-3微载体在RCCS内进行动态培养,观测肝细胞的生长情况和细胞代谢率。结果肝细胞在Cytodex-3微载体上生长迅速、生长倍增时间缩短,并保持很高的生物活性。培养至第5天,细胞数量可达最初接种的23倍。细胞的数量在第5天左右达到最高,然后开始下降。功能学检查、倒置显微镜、扫描电镜及MTT均提示细胞功能良好。结论RCCS微载体肝细胞大规模培养是一种可行的细胞快速扩增方法,但对于人工肝庞大的细胞数量和功能需求,应进一步研究,通过优化营养和废物排除,模拟肝脏生理结构,提高细胞培养规模和功能。

荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞体内示踪方法

背景:利用荧光染料标记活细胞体内示踪的方法较多,但是应用荧光染料浓度差异实现不同细胞体内示踪的方法目前仍不成熟。目的:观察不同浓度荧光活性染料CFSE标记的小鼠脾细胞体内示踪情况,建立稳定的单染料差异浓度标记活细胞的体内示踪方法。方法:取C57BL/6J及BALB/c小鼠脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度CFSE染色后制备1∶1混合细胞悬液;锥虫蓝染色鉴定细胞活性;将染色的混合细胞输注BALB/c小鼠后不同时间点,流式细胞仪检测小鼠外周血两种荧光细胞的比例。结果与结论:CFSE标记的小鼠脾细胞活力良好,荧光显微镜下见全部细胞标记后均发绿色荧光,形态正常,CFSE标记阳性率为95%。CFSE染色时,在浓度相差20倍时流式直方图才显示为两个完全独立的峰,即CFSE低浓度用0.3μmol/L高浓度用6μmol/L。异基因的C57BL/6J脾细胞在输注1d后就快速消失,而同基因BALB/c脾细胞能够在BALB/c小鼠外周血中长期存在,但是两种细胞荧光强度均未见降低,说明荧光染料CFSE差异浓度标记活细胞进行体内示踪是一种稳定的示踪方法。

2014-2015年医院感染菌的分离及药敏分析

目的:分析粤北人民医院2014-2015年医院感染菌对临床常用抗生素的敏感性,为临床合理使用抗生素提供依据。方法:采用MIC法对两年分离菌进行药敏试验,应用WHONET 5.6和SPSS 13.0软件进行数据分析,并比较两年间抗生素敏感度变化。结果:我院分离的临床菌株对部分抗生素仍然保持高度敏感性,革兰阳性菌对替考拉宁、万古霉素、利奈唑胺、阿米卡星、呋喃妥因、高浓度庆大霉素均表现出较高的敏感率,而革兰阴性菌对多粘菌素B、头孢替坦、阿米卡星敏感率高;2014年与2015年相比,革兰阳性菌中氨苄西林、阿米卡星、米诺环素、克林霉素、复方新诺明比较有统计学意义(P<0.05),革兰阴性菌中哌拉西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢曲松、头孢替坦、头孢西丁、头孢克洛、头孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星、米诺环素、氯霉素、复方新诺明比较有统计学意义(P<0.05)。结论:新推广使用的抗生素仍然有好的敏感性;合理使用抗生素有重要的意义。

新型免疫状态定量监测皮肤移植模型小鼠的特异性

背景:器官移植后如何监测受者的免疫状态,并预测排斥反应的发生,从而调整免疫抑制剂的用量是当前面临的重要问题。目的:探索新型免疫状态定量监测方法在小鼠皮肤移植模型中是否有抗原特异性。方法:建立C57→BALB/c皮肤移植排斥模型,分别输注C57/BALB/c混合脾细胞悬液及第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞,在细胞输注后检测2种混合细胞悬液比例变化及供体细胞杀伤率,同时设置BALB/c→BALB/c同系皮肤移植对照组,免疫低下裸鼠对照组及免疫抑制剂对照组与之对比。结果与结论:C57/BALB/c悬液-移植排斥模型组和C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组小鼠对供体C57脾细胞有强烈的特异性杀伤作用,其中C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组特异性杀伤作用稍弱,而输注第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞的小鼠细胞注射2～4h内没有明显特异杀伤作用,但免疫低下的裸鼠始终未表现出特异性杀伤。说明实验建立的抗原特异性免疫状态检测方法能够快速地检测出皮肤移植受体的免疫状态。

携带GFP基因逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞

目的应用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒感染原代培养脐带基质间充质细胞,为细胞重编程实验提供有效基因转移载体。方法利用酶消化法在体外分离培养脐带基质间充质细胞。应用磷酸钙法将GFP基因转染到293T细胞内,包装生产携带GFP基因的逆转录病毒。收集病毒上清液感染脐带基质间充质细胞,应用倒置荧光显微镜观察逆转录病毒感染脐带基质间充质细胞情况。结果体外分离培养出脐带基质间充质细胞;293T细胞包装生产携带GFP基因逆转录病毒;包装生产后的逆转录病毒成功地感染脐带基质间充质细胞。结论逆转录病毒可作为有效载体将外源性基因转染入脐带基质间充质细胞内,并且细胞能够稳定表达被导入的外源性基因。

逆转录病毒介导系统感染原代培养人皮肤成纤维细胞

目的利用包装生产逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞,为细胞重编程提供技术保证。方法利用组织块贴壁法体外原代培养人皮肤成纤维细胞。包装生产携带绿色荧光蛋白GFP基因的逆转录病毒上清液。收集逆转录病毒上清液感染原代培养人皮肤成纤维细胞,利用荧光显微镜观察逆转录病毒感染成纤维细胞。结果体外成功原代培养出人皮肤成纤维细胞。293T细胞包装生产携带GFP基因的逆转录病毒上清液。包装生产后逆转录病毒成功地感染原代培养人皮肤成纤维细胞。结论逆转录病毒介导系统是人皮肤成纤维细胞重编程的有效基因转移载体。

海藻糖对生物人工肝用人永生化肝细胞系C3A细胞低温的保存

背景:随着生物人工肝在临床上的应用,需要有一种方便、有效、实用的保护生物反应器装载细胞活力及功能的方法,设计有自主知识产权的生物人工肝用肝细胞的低温保护液迫在眉梢。目的:验证海藻糖作为低温保护剂在4℃低温保存肝细胞的作用。方法:采用C3A人永生化肝细胞系在不同低温保存液(DMEM培养液,乳酸钠林格氏液,加有不同浓度海藻糖的乳酸钠林格氏液,UW液)4℃保存24,48,72h。复苏后行细胞活力、细胞损伤指标、氧自由基代谢相关指标等检测,并通过荧光双染法观察细胞凋亡情况。结果与结论:不同低温保存液保存不同时间C3A细胞的活力、细胞损伤及细胞凋亡表现均有所不同,其中同时间点不同浓度海藻糖组均优于单用乳酸钠林格氏液组,但不如UW液组(P<0.01)。而保存24h的不同浓度海藻糖组及UW液组与乳酸钠林格氏液组相比差异无显著性意义(P>0.05),提示海藻糖能有效减轻低温对肝细胞凋亡及缺血再灌注损伤的程度,可成为低温保存液中有效及重要的保护剂组分。

利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞编程为多潜能干细胞

目的:探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因将脐带基质间充质细胞(UMC)编程为多潜能干细胞(iPS)的可能性。方法:原代分离培养UMC细胞,包装生产逆转录病毒感染UMC细胞,将感染后细胞接种到饲养层细胞培养,镜下观察细胞形态学变化。对编程后细胞进行碱性磷酸酶(AP)染色、检测细胞基因表达量和体内分化畸胎瘤实验。结果:获得原代UMC细胞,细胞被编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rex1表达量增高,外源编程基因Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc表达沉默,细胞体内分化为畸胎瘤。结论:利用Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因能将UMC细胞编程为iPS细胞。

某院嗜血杆菌临床分布与药敏特征

目的探讨我院嗜血杆菌临床分布特点与药敏情况，为，临床诊断与治疗提供依据。方法选取我院2014—2015年全院细菌培养患者为对象，分析嗜血杆菌属培养阳性的患者年龄、性别，标本类型、临床科室分布和季节性特点，且对菌株药敏情况进行统计分析。结果流感嗜血杆菌除2月、4月份未能检出，其他月份均有分布；副流感嗜血杆菌全年均可检出，以3～5月分布最多；在105株嗜血杆菌属中，以副流感嗜血杆菌最多，其次为流感嗜血杆菌、b型流感嗜血杆菌，副溶血嗜血杆菌，未检测到其他嗜血杆菌；临床科室以内科为主，呼吸内科最多；年龄分布以老年患者最多，但也同时存在于儿童患者中（包括婴儿）；除复方新诺明耐药率较高外，其他抗生素均保持较高敏感性。结论我院分离的嗜血杆菌属流行具有一定季节性，科室分布以内科为主，抗生素敏感性仍较好。

一种简易的人原代肝细胞分离培养方法

背景:采用原位两步灌流法分离肝细胞数量多,活性高,但灌流装置价格昂贵,操作环节多,技术要求高,所需时间长,易污染,限制了在一般实验室及人原代肝细胞在医学中的应用。目的:建立人原代肝细胞体外分离培养方法。方法:采用多点穿刺灌注方法将预温38℃的前灌流液及Ⅱ型胶原酶溶液灌依次灌入人肝脏组织中,经消化及离心后获得人原代肝细胞;倒置显微镜和电镜观察细胞形态特征,并鉴定。结果与结论:经多点穿刺灌注法消化分离后可获得约5×105个肝细胞,分离获得的肝细胞活率达90%;细胞培养24h后呈铺路石样生长;电镜示肝细胞呈典型形态特征:细胞核大,胞质少;培养的肝细胞PAS糖原染色阳性,白蛋白表达阳性。说明多点穿刺灌注法分离人原代肝细胞简单易行,肝细胞产量高、活力好、纯度高,分离培养的肝细胞具有特异性生物学功能表达,适宜在一般条件实验室推广应用。

人源肝细胞系CL-1、HepFMMU、HepG2、C3A生物学特性与功能的比较

目的:比较体外培养的四种人源肝细胞系CL-1、HepFMMU、HepG2、C3A生物学与功能特性的异同,初步评价其应用于生物人工肝的可行性,为其在组织工程学研究和临床医学中的应用奠定基础。方法:4种肝细胞在接种密度相同的条件下培养7d,观察4种细胞形态特征和功能状态,检测培养液中白蛋白、尿素及安定代谢量。结果:4种肝细胞系均具有较快的生长速度,功能学比较C3A具有良好的白蛋白合成和安定代谢功能;CL-1具有良好的尿素合成功能。结论:4种肝细胞具有良好的增殖能力,C3A具有良好的白蛋白合成及安定代谢能力,但其尿素合成能力较差,需进一步改进;CL-1具有较好的尿素合成能力,但其安定代谢和白蛋白合成功能较差;HepFMMU功能较差,不适宜用于生物人工肝。

灌注式RCCS生物反应器CFD模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响

目的:探讨利用微重力旋转细胞培养系统(RCCS)生物反应器仿真模拟分析微载体旋转对细胞氧供的影响。方法:联立不可压缩牛顿流体连续性方程和动量守恒方程、微载体内以及流动空间中氧的传递和反应方程,设置参数并求解;以Gamb it建立RCCS网格模型,并用F luent软件在欧拉多相模式下进行生物反应器数值模拟及流体力学分析。结果:以微载体直径及RCCS旋转速度作为自变量,基于欧拉-欧拉多相模型和氧运输公式成功建立RCCS数值分析模型。微载体直径和旋转速度均影响细胞培养效率,直径200、300、400μm的微载体旋转速度分别为10、12、14 r/m in;旋转1 h后直径600μm的微载体RCCS中间区平均氧浓度增加85%。结论:CFD可以定量模拟分析影响微载体及氧供的相关因素,为优化培养条件提供参数。

人皮肤成纤维细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定人皮肤成纤维细胞（HSF）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法利用逆转录病毒将Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc基因导入原代HSF细胞，将其编程为iPS细胞。检测细胞内源、外源基因表达量，鉴定外源基因是否插入iPS细胞，分析细胞核型，细胞碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色，体内分化畸胎瘤，体外分化拟胚体实验，对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS细胞内源多能基因（Nanog、Oct4、Rexl、Sox2）表达量增高，外源编程基因（Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc）表达量降低。（3）琼脂糖凝胶电泳实验证实外源基因插入iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常，碱性磷酸酶活性增高，表达ES细胞特异性蛋白。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤，在体外能分化为拟胚体。结论新建立的iPS细胞类似于ES细胞具有多向分化潜能。

胰腺内皮细胞共培养对C3A细胞功能变化的影响

目的 探讨与胰腺内皮细胞共培养时C3A细胞功能变化.方法 选择C3A细胞与胰腺内皮细胞的密度比例为10：1分别进行直接和间接共培养7 d,同时设立空白对照组,观察各实验组细胞生长和形态特征,分别用杜邦全自动生化分析仪、放射免疫分析法和ELISA法检测培养液中AST、ALT漏出量,白蛋白含量和安定代谢量.结果 C3A细胞与胰腺内皮细胞直接共培养第5、7天能显著降低ALT、AST的漏出量,第7天提高白蛋白合成量最高达12.977μg/ml和提高安定代谢能力;C3A细胞与胰腺内皮细胞间接共培养在第5、7天也能显著提高白蛋白合成量到7.380μg/ml、10.773μg/ml.结论 与胰腺内皮细胞直接与间接共培养均能明显改善C3A细胞的功能.

脐带间充质细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定脐带间充质细胞（UMC）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法以逆转录病毒作为Sox2、KIf4、Oct4、c—Myc基因转移载体，将UMC细胞编程为iPS细胞。应用RT-PCR检测细胞基因表达量，鉴定外源编程基因是否整合到iPS细胞核内，分析细胞核型，对细胞进行碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色，体内分化畸胎瘤和体外分化拟胚体实验，对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态学上类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS与ES细胞内源多能基因（Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2）表达谱相类似，外源编程基因（Sox-2、KIf4、Oct-4、c—Myc）表达发生沉默。（3）外源编程基因已被插入到iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常，碱性磷酸酶活性增高，表达Es细胞特异性膜蛋白（SSEA3、SSEA4），质蛋白（TRA-1-60、TRA-1—81），核蛋白（Nanog）。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤，在体外能分化为拟胚体。结论iPS细胞类似于Es细胞具有多向分化潜能。