人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯复合生物敷料对大鼠烧伤创面修复作用的实验研究

目的以人发角蛋白-胶原海绵为敷料内层,复合包裹药物虎杖的聚甲基丙烯酸羟乙酯载体,制备一种双层复合生物材料,研究其对烧伤创面的促愈合作用,探讨将其作为烧伤敷料的可行性。方法(1)将在体内具有慢(Z)、中(B)、快(F)三种吸收速度的人发角蛋白组分材料编织成网孔为1mm×1mm的网格,与从牛跟腱中抽提I型胶原溶液混合后放入模具,经真空冷冻干燥后制成海绵状膜(作复合内层敷料),扫描电镜观察其结构。(2)用聚合法制备聚甲基丙烯酸羟乙酯,再与药物虎杖一同成膜,制备药物缓释载体膜(作复合外层敷料),紫外光谱仪测定其释药度。(3)用SD大鼠制备深Ⅱ°烧伤动物模型,并于烧伤后2～5d内清除坏死组织,保留部分变性真皮组织。清创后将用与创面相同大小的人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯复合敷料覆盖创面,已用于临床的戊二醛猪皮作为阳性对照组。术后以创面完全上皮化为标准,记录创面愈合时间并分别计算第7、14、21天愈合率。(4)分别于覆敷料后1、2、4、6、8周切取整个创面及其周围组织(每组每个时间点取6个标本),行光学显微镜观察和免疫组织化学染色观察,作3组的愈合时间及第7、14、21天的愈合率比较。结果胶原海绵膜为孔径为50～300μm的三维立体状结构。经测定在0～48h内药物虎杖从聚甲基丙烯酸羟乙酯膜内不断释出。深Ⅱ°烧伤治疗实验结果:实验组创面覆盖后渗出明显减少且保持一定湿度,而对照组创面较干燥;实验组及阳性对照组的创面愈合时间较阴性对照组提前;创面在第7、14、21天的愈合率均较阴性对照组高,且实验组在第14天的愈合率较阳性对照组高。结论人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯/虎杖复合生物敷料可促进深Ⅱo烧伤实验大鼠创面的愈合,起到在体内构建组织工程化皮肤的目的。通过控制合成工艺,聚甲基丙烯酸羟乙酯膜作为药物缓释载体是可行的。

RP-HPLC测定雷诺嗪含量及有关物质

目的:建立测定雷诺嗪(ranolazine)含量及有关物质的反相高效液相色谱法。方法:依利特Hypersil BDS C_(18)硅烷键合硅胶柱(250mm×4．6mm,5μm),流动相:甲醇-7mmol·L^(-1)醋酸铵与3．5mmol·L^(-1)醋酸的缓冲液(65:35),流速:1．0mL·min^(-1),柱温:30℃,检测波长:272nm。结果:雷诺嗪在0．102～2．034mg·mL^(-1)的范围内,浓度和峰面积线性良好,r=0．9999。重复性试验的RSD为0．92%。结论:测定方法简便快速、重现性好、准确度高,可适用于雷诺嗪的含量测定及其有关物质检查。

复合生物敷料人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯对大鼠烧伤创面的治疗作用(英文)

背景:作者在对人发角蛋白的机制研究和临床应用中提出了一个全新的组织工程学概念--在体/原位组织工程。在该理论的指导下,拟以人发角蛋白-胶原海绵为支架,复合一种可作为药物缓释载体的聚甲基丙烯酸羟乙酯,探讨其在体内原位诱导周围组织细胞构建真皮的可行性。目的:以人发角蛋白-胶原海绵为敷料内层,复合包裹药物虎杖的聚甲基丙烯酸羟乙酯载体,制备一种双层复合生物材料,观察其对烧伤创面的促愈合作用。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-03/12在南方医科大学组胚教研室完成。材料:选用雄性SD大鼠15只制备烧伤动物模型,将模型鼠完全随机分为3组:实验组,阳性对照组及阴性对照组。方法:①将在体内具有慢、中、快3种吸收速度的人发角蛋白组分材料编织成网孔为1mm×1mm的网格,与从牛跟腱中抽提Ⅰ型胶原溶液混合后放入模具,经真空冷冻干燥后制成海绵状膜(作复合内层敷料)。②用聚合法制备聚甲基丙烯酸羟乙酯,再与药物虎杖一同成膜,制备药物缓释载体膜(作复合外层敷料)。③用SD大鼠制备深Ⅱ度烧伤动物模型,烧伤后3d做清创处理,清创后实验组用与创面相同大小的人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯复合敷料覆盖创面,阳性对照组用戊二醛猪皮覆盖创面,阴性对照组为单纯无菌纱布覆盖。主要观察指标:①术后以创面完全上皮化为标准,记录创面愈合时间并分别计算7,14,21d愈合率。②于覆敷料后1,2,4,6,8周切取整个创面及其周围组织,光学显微镜观察肉牙组织生长情况和免疫组织化学染色观察新生组织中的胶原纤维和弹性纤维形态。结果:①实验组创面覆盖后渗出明显减少且保持一定湿度,而阳性对照组创面较干燥;实验组及阳性对照组的创面愈合时间较阴性对照组提前(P=0.000);创面在7,14,21d的愈合率均较阴性对照组高(P=0.000),且实验组在14d的愈合率较阳性对照组高(P<0.05)。②覆敷料后2周,光镜下观察可见创面肉芽组织中有较细小的胶原纤维填充创面。实验组较其他2组明显。胶原蛋白及弹性蛋白的免疫组织化学染色显示:第2周,实验组创面真皮基质中,Ⅰ型胶原呈棕黄色细密条带状;且有少量被染成棕黄色细丝状的弹性纤维,阳性对照组不明显,而阴性对照组中弹性蛋白无阳性表达。第8周,3组创面均愈合良好。实验组及阳性对照组胶原纤维束改造塑形,无瘢痕形成趋势。阴性对照组真皮层组织排列紊乱。结论:人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯/虎杖复合生物敷料可促进深Ⅱ度烧伤实验大鼠创面的愈合。

胆总管结石的成因观察

目的探讨细菌感染、胃肠激素及胆汁生化在胆总管结石形成中的作用.方法实验分为胆总管结石(CBDS)组(n=56)、非结石胆总管梗阻(NCBDS)对照组(n=16).①内窥镜下逆行胰胆管造影术(ERCP)中抽取胆汁作需氧菌培养及进行总胆汁酸(TBA),Ca2+,P2+和胆固醇(CHO)测定.②ERCP术中取结石用PCR法行结石大肠杆菌检测.③采静脉血行胃动素及生长抑素检测.结果①CBDS组56例胆汁标本需氧菌培养中,有53例检出细菌(95%),NCBDS组16例胆汁标本中,有8例检出细菌(50%),两组细菌检出率比较有统计学意义(P<0.05).用PCR方法对11例CBDS患者结石进行大肠杆菌DNA片段检测,3例出现阳性(27%).②CBDS组血浆胃动素水平较NCBDS组明显偏低(202±151vs315±161)ng/L,而生长抑素则明显升高(15±5vs12±3)ng/L,组间比较差异显著(P<0.05).③CBDS组胆汁中Ca2+显著高于NCBDS组[(1.4±0.9vs0.7±0.3)mmol/L,P<0.05],TBA则显著低于NCBDS组[(12±6vs16±7)nmol/L,P<0.05].结论胆汁理化性质改变、胆道感染及胃肠激素紊乱在胆管结石形成中可能具有重要作用.

三七药材指纹图谱的研究

目的研究三七药材指纹图谱。方法采用反相高效液相方法(HPLC):C18(250.0mm×4.0mm,5μm)色谱柱,以乙腈-水为流动相,梯度洗脱,检测波长203nm。结果建立了三七药材的HPLC指纹图谱。结论该方法简单,重现性好,具可操作性,能用于三七药材的鉴别与评价。

对二甲基丙烯酰胺偶氮苯的合成

用过硫酸铵还原对硝基苯胺,得到对二硝基偶氮苯;对硝基偶氮苯再用硫化钠还原得到对二胺基偶氮苯;对二胺基偶氮苯和甲基丙烯酰氯进行酰化反应得到对二甲基丙烯酰胺偶氮苯。用红外光谱、核磁共振谱和元素分析确定其结构,用紫外光谱测其光谱性质。合成路线优化,产率高。

鸡羽根管作为组织工程支架材料的初步研究

目的了解鸡羽根的结构特点,观察其在活体组织内的降解情况及其对周围组织的影响,为其作为组织工程备选支架材料提供依据。方法健康鸡羽根,采用序贯的、不同程度(轻、中、重)理化处理程序,得到3种鸡羽根角蛋白(CCK-I、CCK-II、CCK-III),光学显微镜/扫描电镜观察其形态结构。大鼠背部肌组织内植入鸡羽根角蛋白片(实验组)和未处理鸡羽根片(对照组),以及坐骨神经束间植入鸡羽根角蛋白丝(实验组)和未处理羽根丝(对照组),于不同时间点取材,观察其降解情况和组织相容性。结果(1)光镜:鸡羽根管壁从内到外依次为4个致密层:嗜碱性均质状粗线,3￣5层的嗜酸性角质层,60￣100层含大量色素颗粒的环行角蛋白束和10￣20层含少量色素颗粒的角蛋白束。扫描电镜:未处理的鸡羽根结构致密,管壁平整,无孔洞;处理后结构较疏松,可见大小、深浅不等的孔洞。(2)肌组织内植入:第8周材料呈细丝状或散在细颗粒状,部分被降解吸收,仍有少量炎性细胞,可见多核巨细胞;第12周材料降解为细小碎片。对照组各时间段材料结构完整。(3)神经束间植入:引起的组织反应与细胞类型同肌组织内植入组,神经组织无变性、坏死。结论未处理的鸡羽根由多层致密的角蛋白束构成,含色素颗粒和少量基质。处理后表面出现许多孔洞,结构疏松,且体内可降解,其降解产物不引起机体组织的变性、坏死。鸡羽根有可能成为组织工程化器官或组织构建的备用支架材料。

HPLC-ELSD法测定苦杏仁中苦杏仁苷含量的研究

目的建立高效液相色谱法-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定苦杏仁中苦杏仁苷含量的的分析方法。方法采用Hypersil-ODS(4.0mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相为甲醇-水(30∶70),流速0.5ml/min;柱温25℃;利用ELSD检测器检测:漂移管温度98℃,载气流速3.2L/min。结果苦杏仁苷进样量在1.0￣15.1μg范围内,标准曲线呈良好的线性关系,r=0.9999,苦杏仁苷的平均回收率为99.0%,RSD为2.9%(n=5)。结论本方法简便快速,结果准确可靠,为苦杏仁苷的含量测定提供了一个新方法,可用于苦杏仁药材及含苦杏仁复方制剂的质量控制。

CYP3A4基因原核表达质粒构建与诱导表达

以质粒pCWNF14为模板,采用PCR技术扩增出CYP3A4基因,并将其接入pET-22b(+)、pET-28b(+)和pET-32a(+)载体中,经PCR测序鉴定后,转化Rosetta(DE3)2pLysS细菌,并用IPTG诱导表达.采用考马斯亮蓝染色的方法检测重组蛋白表达,3个表达重组质粒中,只有pET-32a(+)-CYP3A4可以表达目的蛋白;在低浓度IPTG(50μmol/L)诱导6h,所表达的CYP3A4蛋白约占细菌总蛋白的40%,且该蛋白不溶于8mol/L的尿素,而溶于去污剂10mmol/L3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio propanesulfonic acid(CHAPS))和0.3%lauroyl sarcosine(SKL).成功地使CYP3A4基因在原核系统中高效表达.

LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效率比较

目的:比较LipofectAMINE2000与Fugene6转染细胞的效果。方法:将含有Firefly和Renilla荧光素酶基因的质粒分别用LipofectAMINE2000和Fugene6转染293T、HepG2和DLD-1细胞,于48h后裂解细胞测定荧光素酶活性。结果:在293T细胞中,LipofectAMINE2000转染组的萤火虫(Firefly)和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的6.5和5.6倍(P<0.005);在HepG2细胞中,LipofectAMINE2000转染组的Firefly和Renilla荧光素酶活性分别是Fugene6转染组的44和49倍(P<0.001);而在DLD-1细胞中,两者无差别。结论:转染试剂LipofectAMINE2000和Fugene6对不同细胞的转染效果存在差异,当进行转染实验时,对于不同的细胞须根据情况进行选择。

鸡羽根角蛋白管毒性作用的研究(英文)

目的观察鸡羽根角蛋白管作为组织工程材料的毒性作用。方法分别制备不同处理强度的3种鸡羽根角蛋白管的浸提液并测定其化学成分。采用皮肤致敏实验(大鼠)、皮内刺激实验(家兔)、小鼠全身急性毒性实验以及体外细胞毒性实验观察鸡羽根角蛋白管浸提液的体内和体外毒性作用。结果鸡羽根在浸出液中释放的主要物质为中等分子量的肽类物质,大分子蛋白释放不多。皮肤致敏实验和皮内刺激实验显示对浸提液不引起皮肤及皮内红斑、水肿和坏死现象。小鼠全身急性毒性实验中,腹腔注射浸提液的小鼠未出现死亡、衰竭、发绀、震颤、严重的腹膜刺激、眼睑下垂及呼吸困难等毒性症状。体外细胞毒性实验示浸提液细胞毒性接近于0级。结论鸡羽根角蛋白管可被水解,释放一些肽类物质,其浸提液对皮肤无致敏作用,皮内刺激反应弱,不引起全身急性毒性症状,无细胞毒性。

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。

病毒SET蛋白对细胞基因的表观遗传学阻遏——一种可能的基因沉默新技术

选择性地沉默致病基因的方法之一是修饰该基因所在染色质中的组蛋白,特别是对组蛋白H3的修饰。绿草履虫绿球藻病毒(PBCV)能用病毒蛋白修饰宿主染色质,和应用宿主的转录机器进行病毒复制,进而抑制人类细胞中目标基因的转录表达,其中包括一些与许多疾病的发作有关的基因。通过使某些基因沉默,能够抑制那些会导致艾滋、癌症、发炎、以及中枢和周围神经系统疾病的基因。但是用于临床治疗还有很长的路要走。