实时荧光定量PCR检测外周血TREC的方法研究

目的建立及优化检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)的方法及实验影响条件,为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建机制提供方法学基础。方法在ABI7000PCR仪上实时扩增检测构建的TREC质粒标准品,摸索最佳扩增条件及建立标准曲线,然后用优化的FQ-PCR方法检测临床样本。结果T3、T4引物和R3、R4引物的扩增效率分别优于T1、T2引物和R1、R2引物。TaqMan-MGB探针比普通的TaqMan探针扩增效率高。金牌热启动Taq酶,比较普通Taq酶而言,提高了PCR的特异性和敏感性。FQ-PCR的反应条件设定:95℃10min后95℃5s,53℃30s,40循环结束。结论通过摸索与优化实验条件,建立了实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中TREC的方法。

PCR-SSP法HLA-A、B基因分型与血清学分型的比较

目的比较聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-Ⅰ类A、B抗原位点分型的准确性,并探讨血清学分型错误发生的原因。方法用PCR-SSP以及单克隆抗体血清学分型技术对HLA-A、B分型并比较。结果34例样本PCR-SSP基因分型无假阳性和假阴性出现。PCR-SSP法与血清学比较,血清学检出错误或漏检率分别为HLA-A位点23.5%,B位点26.5%。血清学发生错误或易混淆的抗原有:A2和A68、A32和A33,B5、B60和61。结论PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原等位基因分型具有分辨率高、特异性强、重复性好、实验过程简捷快速、分型结果较血清学更加准确可靠的优点。

基因芯片检测广东省汉族人群HLA-DQB1基因多态性

目的调查研究了700名广东省汉族人群HLA-DQB1等位基因频率及多态性分布。方法采用深圳益生堂生物企业有限公司研制开发的“HLA-DQB1低分辨率基因分型芯片试剂盒”,应用PCR-SSP+SSO芯片检测技术,对700名广东省的中国人群进行基因分型。结果鉴定了10个HLA-DQB1等位基因。广东省人群HLA-DQB1等位基因频率分布为HLA-DQB1*05>*0301>*0303>*0601>*02>*0302>*04>*0602>*0604>*0603。结论为我国疾病相关性研究、人类学研究提供了可靠的遗传学参数。

拟肾移植透析患者PCR-SSP HLA分型影响因素分析

目的 分析拟肾移植透析患者HLA分型的某些影响因素。方法 对 4 87例拟肾移植的透析患者采用PCR -SSP的方法进行HLA分型 ,对HLA分型位点不明确的血标本用生理盐水洗涤 1次后 ,再用上述方法进行HLA分型。结果 4 87份样本中 ,2 8.34% (138例 /487例 )HLA分型位点不明确 ,存在部分特异性带模糊不清或假阴性带。对HLA分型位点不明确的血标本用生理盐水洗涤 1次后再进行HLA分型 ,得出满意结果。结论 可能是肝素影响了TaqDNA聚合酶的活性 ,导致扩增带弱或出现假阴性带。

脐带血移植治疗重型地中海贫血的HLA配型策略

目的建立针对重型地中海贫血(简称地贫)移植治疗前HLA配型策略,探讨重型地中海贫血患儿与其母妊娠胎儿之间,是否可以接受移植治疗,减少过度医疗消费,减轻患者经济负担。方法①采用反向探针杂交技术,确定患儿及其父母亲的地贫基因型;②对确诊重型地中海贫血患儿拟采取脐带血移植治疗时,抽取母亲妊娠16周±胎儿羊水进行地贫基因诊断及HLA配型。结果10例重型地贫中有8例拟行脐带血移植治疗,其中3/8例胎儿HLA与患儿全相合,2/8例不相合自愿终止妊娠,还有3/8例不相合继续妊娠。结论①胎儿羊水HLA配型对重型地贫脐带血移植治疗供体选择有重要意义;②一次性抽取羊水即可实施地贫基因诊断又可HLA配型;③计划配型策略可以指导重型地贫父母正确选择脐血移植供体,继续妊娠或终止妊娠。

华南、华北人群HLA-DQB1等位基因多态性

目的从基因水平调查了中国华南、华北地区人群HLA-DQB1等位基因频率,并研究比较两地区人群HLA-DQB1多态性分布。方法采用深圳益生堂生物企业有限公司研制开发的“HLA-DQB1低分辨率分型基因芯片检测试剂盒”,应用聚合酶链反应-序列特异性引物+序列特异性寡核苷酸探针芯片检测技术,对700名南方地区的中国人和320名北方地区的中国人进行基因分型。结果鉴定了10个HLA-DQB1等位基因,获得了一组准确、科学的统计数据。结论得到了中国华南、华北地区人群HLA-DQB1等位基因频率差异的数据,证明中国人群HLA-DQB1*02,05,0601,0602,0603的分布南北差异有统计学意义(P<0.05),为疾病相关性研究、人文科学研究提供了可靠的遗传学数据。