转基因大豆、玉米、油菜和水稻品系特异性检测质粒标准分子的快速构建及应用

本文采用重叠延伸PCR技术快速构建了转基因大豆GTS40-3-2、玉米NK603、油菜RT73和水稻TT51-1的4种品系作物的质粒标准分子.经快速PCR鉴定及测序分析验证后,将构建的阳性质粒标准分子应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建,并建立其相应的荧光定量PCR检测体系,同时对该体系的扩增效率、精确度、灵敏度等指标进行了评估.结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测体系中,目标序列的扩增效率均在97.434%～101.479%正常范围内(R2≥0.995),定量极限为20 copies,表明我们已成功构建了这4种转基因作物的品系质粒标准分子,并能有效应用于实时荧光定量PCR标准曲线的构建.

太极拳运动对老年人骨骼肌全基因组表达的影响

目的:研究太极拳运动对骨骼肌全基因组表达的影响及太极拳促进健康的分子机制。方法:6名健康的老年人(65.5±8.9岁)参加了为期12周的太极拳训练。在训练前后分别对实验对象进行肌活验,提取总RNA,经处理后与Affymetrix U133A基因芯片进行杂交,分析数据。结果:太极拳运动使老年人骨骼肌全基因组表达发生明显改变,筛选出725条表达有差异的基因。本文对表达差异最显著的20条差异表达基因进行研究(3条基因表达上调,17条基因表达下调)。根据基因功能分类对比,差异表达基因分别归属8种细胞组分和生物过程,经KEGG搜索找到4条基因的代谢途径。结论:太极拳运动有助保持神经系统的灵敏性,提高反应能力,有助于抗衰老和减肥等,而不利于骨骼肌蛋白质的合成。

有氧运动对老年慢性阻塞性肺病患者骨骼肌全基因组表达的影响

目的:研究有氧运动对慢性阻塞性肺病患者骨骼肌全基因组表达的影响及其促进健康的分子机制。方法:6例COPD患者参加了有计划的太极拳训练,在训练前和训练12周后,分别对实验对象的骨骼肌进行针吸活组织采样,经处理后采用基因芯片进行全基因组表达检测。结果:本研究将全基因组表达芯片技术、BRB基因分析软件及DAVID在线搜索的生物信息学手段相结合,对基因芯片生物信息进行初步探索。筛选出差异表达基因55条(其中10条表达下调,45条表达上调)。进行生物信息学分析后,发现有氧运动使核糖体蛋白基因(包括PRL28、PRS19、SNRPF、RPS21、SNRPE)表达下调,内毒素抑制蛋白(CRI1)基因表达上调,与COPD患者炎症细胞的抑制有关。结论:PIK3R1基因表达上调可能是导致TNF-α基因表达下调的分子机制。在众多调节机制和代谢途径中,各条基因的表达变化都与PIK3R1基因表达上调有关。

用于基因数据挖掘的基因表达数据库GEO

使用高通量方法学来检测基因表达情况在最近几年已非常普遍。微集芯片技术可同时定量成千上万的基因转录本。基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus简称GEO)是目前最大的而且完全公开的高通量分子丰度数据库,主要储存基因表达数据。该数据库以一个灵活开放的设计理念,允许用户或科研人员来递呈,保存和检索多种不同类型的数据。综述了近年来该数据库在基因表达数据挖掘中的应用,同时介绍一些通过使用用户友好网络界面能有效探索、查询和再现数百个实验和数百万个基因表达谱的工具,以方便数据进行挖掘和可视化。登录GEO公用数据库的网址为:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo。

应用限制性显示技术制备HCVcDNA诊断基因芯片的初步研究

制备丙型肝炎病毒 (HCV)检测芯片并进行验证、初步检测质量评价。采用限制性显示 (Restrictiondisplay ,RD)技术制备芯片探针 ,从载体pCV_J4L6S中切出HCV全长cDNA ,Sau3AⅠ酶消化 ,所得的限制性片段进行RD_PCR扩增 ,经聚丙烯酰胺电泳 (PAGE)结合银染法进行分离。切胶回收后作 3次PCR ,得到较纯净的HCVcDNA限制性片段。扩增后的产物克隆至pMD18_T载体进行快速鉴定。将筛选出的限制性片段打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片进行杂交验证分析 ,对芯片检测进行优化、初步的质量评估。运用RD技术 ,得到 2 4个 2 0 0～ 80 0bp、大小均一的基因片段 ,序列分析表明 ,均属于HCV特异基因 ,可以作为诊断芯片探针 ;杂交、测序结果显示 ,芯片检测的敏感性、特异性、准确度、重复性、线性等指标均佳。利用RD技术制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法 ;制备的诊断芯片可以用于检测HCVRNA ,具有敏感、检测结果较为可靠的优点。

CML患者骨髓单个核细胞基因表达谱分析

目的探讨慢性髓细胞性白血病(CML)的基因表达变化。方法分别从正常人和CML患者骨髓样品中抽取骨髓单个核细胞,分离出cDNA片段,然后再逆转录成cRNA并标记后,与人的全基因组表达谱芯片杂交,ABI1700芯片分析系统进行分析基因表达谱的差异。结果总共发现差异表达的基因有6706个,其中与CML相关的差异基因有75个(上调19个,下调56个)。结论全基因组寡核苷酸基因芯片在分析基因表达谱差异研究中具有广泛的应用价值。

EB病毒活化对鼻咽癌基因表达模式的影响

背景与目的:EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染在鼻咽癌发生中发挥重要作用。本研究的目的在于探讨潜伏的EBV活化后形成的复发感染对鼻咽癌发生过程中全基因组表达的影响。方法:收集EBV阳性(EBV+)/EBV阴性(EBV-)的鼻咽癌靶标基因表达谱和EBV复发感染次数不同的鼻咽癌细胞株基因表达谱,通过生物信息学手段对其进行交叉比较,统计学分析筛选出25个差异基因。运用DAVID(database for annotation,visualization and integrated discovery)、pSTIING(protein,signaling,transcriptional interactions and inflammation networks gateway)、GATHER(gene annotation tool to help explain relationships)和TELiS(transcriptionelement listening system)在线分析工具对25个共同差异基因进行表达模式的预测。结果:与EBV初次感染时的基因表达谱比较,仅有DUSP1、TOP1、HOXA9、DEK、IMPDH2、PABPC1等25个基因在EBV复发感染时仍然呈明显差异表达;这25个差异基因及其相关转录因子主要通过2种模式相互作用:一条主要涉及TOP1、DUSP1、DUSP6和RPS28等,另一条是由PITX1、CD9、HOXA9和IMPDH2组成的转录相关环。结论:EBV潜伏后的复发感染,可能通过筛选到的差异基因的2种表达模式发挥功能,最终导致鼻咽癌的发生。

改良Chelex-100法快速提取转基因农产品DNA

旨在建立一种从转基因农产品中快速提取DNA的方法。分别采用改良Chelex-100法和常规CTAB法提取转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA,测其浓度和纯度,PCR扩增其内源基因(Lectin)、启动子(CaMV35S)和品系特异性序列,对两种方法进行比较和评价,并研究两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果,以及改良Chelex-100法在玉米、小麦和水稻等其他转基因农产品的应用效果。结果表明,改良Chelex-100法能够快速在1.5 h之内从样品中提取DNA,所提取的DNA直接用于PCR扩增反应,产物电泳条带清晰明亮。两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果未见明显差别。该方法在玉米、小麦和水稻等转基因农产品的应用效果稳定。因此,改良Chelex-100法提取的DNA可以作为PCR扩增模板用于转基因农产品检测。该方法具有经济、简便、快速、安全的特点,适合转基因农产品大规模筛选和鉴别。

弱精子症患者精子线粒体MTCYB、MTATP6基因的检测

目的:探讨精子线粒体MTCYB、MTATP6基因突变与弱精子症的关系。方法:提取80例成年男性弱精子症和20例活力正常者的精子mtDNA,设计PCR引物并扩增MTCYB、MTATP6基因,PCR产物纯化后进行序列测定和BLAST序列比对。结果:在80例弱精子症样本中有60例同时扩增出MTCYB、MTATP6片段,16例仅扩增出MTATP6片段,4例仅扩增出MTCYB片段。在20例精子活力正常的样本中均同时扩增出MTCYB、MTATP6片段。弱精子症样本中MTCYB和MTATP6基因的缺失率分别为20%和5%。扩增片断的序列分析发现,在弱精子症样本中,MTATP6基因出现G8887A的点突变,突变率为20%,而MTCYB基因未见有规律的突变。精子活力正常的样本中MTCYB、MTATP6基因未检测到明显的点突变。结论:精子线粒体MTCYB和MTATP6的基因缺失以及MTATP6基因的G8887A突变可能影响成年男性的精子活力。

采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库。方法分离肾癌患者的外周血淋巴细胞(PBMC),提取PBMC的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长Kappa型轻链(LCκ)和重链可变区(VH)基因,分别插入载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO10,构建轻、重链抗体基因库,然后将轻、重链抗体基因库联合转染293T细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达。结果成功构建IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库,随机挑选的克隆经DNA序列分析显示轻、重链库的序列正确性达90%(9/10)和80%(8/10),流式细胞仪分析显示来自轻、重链库的上述克隆各有7个可检测到相应基因在293T细胞表面的表达,可表达抗体库库容量高达7.5×1010。结论 IgG1-Kappa型抗肾癌抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,抗体的多样性为下一步筛选特异性抗体奠定良好的基础。

肝组织选择性细胞通讯类基因转录调控网络的构建

目的探讨肝脏组织选择性基因表达的转录调控机制。方法按照基因功能的差异对组织选择性Affymetrix探针集(共3919条探针)进行聚类,挑选肝组织选择性细胞通讯类(LSCC)基因进行研究。收集各基因上游的500个碱基序列,用3种软件分别预测这些基因的转录因子(TFs)以及转录因子结合位点(TFBS),并进行文献挖掘,最后构建基因转录调控网络。结果获得含23个基因的肝组织选择性细胞通讯类探针集,两种软件预测分别得到50和72个TFs,两者交集有18个相同TFs,得分最高前10条TFBS序列基本上与预测的TFs相对应,文献挖掘结果提示LSCC基因和TFs除具有肝组织的选择性、转录因子的一般性词汇外,还与白蛋白、糖尿病、葡萄糖、脂类、代谢、JNK等显著相关。调控网络显示LSCC基因和TFs具有参与糖、脂代谢调节,结合、转运功能,凝血信号转导,炎症应答等功能,未进入网络的PPP2R1B基因与网络中DUSP10基因部分功能相似。结论LSCC基因和预测的TFs参与肝脏多种重要功能的调控,这些功能整合在复杂的转录调控网络中,转录因子JUN可能是发挥调控作用的重要靶点,推测PPP2R1B也可能参与JUN的调控。

弱精子症患者精子中CRISP2基因及蛋白的初步研究

目的:探讨弱精子症患者精子中富含半胱氨酸的分泌蛋白2(CRISP2)mRNA及蛋白的表达水平,探讨其与精子活力的关系及相关的分子机制。方法:收集成年男性弱精子症患者精液78例,活力正常精液70例作为对照组,50% Percoll离心分离纯化后,提取精子总RNA及总蛋白,采用RT-PCR,SYBR Green实时定量PCR和Western印迹技术检测CRISP2 mRNA及蛋白相对表达量。结果:CRISP2基因在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量,下降达4.3倍;Western印迹发现CRISP2蛋白在弱精子症组较正常对照组下降达1.71倍,两组之间的表达量有明显的统计学差异(P<0.05)。结论:CRISP2基因及蛋白在弱精子症患者精子中的表达下调可能与精子活力下降有密切联系,提示CRISP2基因及蛋白可能成为弱精子症发病机制研究的一个分子靶标。

苏云金芽孢杆菌Cry1A(b)抗虫基因LAMP检测方法的建立与应用

以转基因玉米MON810为模板,针对Cry1A(b)抗虫基因核酸保守序列设计特异性引物,建立LAMP检测体系。对该体系的可行性、灵敏性、特异性进行分析,并应用于转基因产品的检测。研究结果显示该方法快速简单、灵敏度特异性高、结果可视化,可应用于转基因产品中Cry1A(b)基因的初步筛选。

乳腺癌转移相关基因的筛选与生物信息学分析

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,转移与复发是乳腺癌患者死亡的主要原因.研究与乳腺癌细胞转移相关的分子靶点对预防乳腺癌术后复发、提高疗效有重要意义.本研究以3组乳腺癌转移相关的基因表达谱数据(GSE2034,GSE2603,GSE12276)为分析材料,采用GeneSpring软件筛选乳腺癌原发瘤与转移瘤芯片数据的差异表达基因,结合生物信息学工具PATHER、STRING、pSTIING和文献挖掘工具iHOP对差异基因及其相互作用关系进行分析.结果显示,共筛选出乳腺癌转移共同差异基因147个,其中表达上调93个,表达下调54个.这些差异基因主要涉及细胞周期与增殖、细胞粘附、细胞迁移、血管形成及信号转导等生物通路和生物过程.差异基因编码蛋白间的相互作用主要集中在14个蛋白,且在更为复杂的网络图谱中仍可见其中9个基因(CXCR4、MMP1、MMP2、MMP3、CTGF、COL1A1、MEF2C、PTGS2及SPARC)在重要的节点位置.文献挖掘发现,COL1A1基因可能为新发现的乳腺癌转移候选基因,为乳腺癌转移的发病机制提供新的思路,也为转移性乳腺癌的分子诊断和个体化治疗奠定基础.

抗酶1基因转染对HeLa细胞增殖及细胞周期的抑制作用

研究抗酶(antizyme)1对人宫颈癌HeLa细胞增殖与细胞周期的影响,并分析抗酶1对细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达影响.采用定点突变技术,将抗酶1的frameshift位点缺失,随后将突变基因重组至真核表达载体pEGFP-N1中,鉴定后转染HeLa细胞.通过MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞术分析抗酶1对细胞周期的影响.RT-PCR和Western印迹检测抗酶1转染对细胞周期蛋白D1基因表达的影响.酶切结果显示,抗酶1突变基因成功克隆至pEGFP-N1中.成功转染HeLa细胞后,检测结果显示,抗酶1能够减慢HeLa细胞增殖速度,并使细胞停滞于G0/G1期,细胞周期蛋白D1基因的表达同时受到抑制.实验说明,抗酶1基因能够抑制HeLa细胞增殖,通过降低细胞周期蛋白D1的表达阻滞细胞周期.

GEO(Gene Expression Omnibus):高通量基因表达数据库

GEO(Gene Expression Omnibus)数据库包括高通量实验数据的广泛分类,有单通道和双通道以微阵列为基础的对mRNA丰度的测定;基因组DNA和蛋白质分子的实验数据;其中包括来自以非阵列为基础的高通量功能基因组学和蛋白质组学技术的数据也被存档,例如基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)和蛋白质鉴定技术.迄今为止,GEO数据库包含的数据含概10000个杂交实验和来自30种不同生物体的SAGE库.本文概述了GEO数据库的查询和浏览,数据下载和格式,数据分析,贮存与更新,并着重分析GEO数据浏览器中控制词汇的使用,阐述了GEO数据库的数据挖掘以及GEO在分子生物学领域中的应用前景.GEO可由此公众网址直接登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/.

基于基因表达谱的途径筛选肺腺癌治疗药物

目的:探讨基于基因表达谱的途径在肺腺癌治疗药物筛选中的应用。方法:从GEO数据库中获得GSE10072和GSE7670两个数据集,然后利用dchip软件进行差异表达基因分析,采用基因集富集方法(gene set enrichment analysis,GSEA)对肺腺癌进行通路富集分析,最后通过Connectivity map(Cmap)筛选肺腺癌候选治疗化合物,并进行实验验证。结果:共获得差异表达基因379个,其中上调基因94个,下调基因285个;GSEA主要富集到细胞周期等18条信号通路与肺腺癌相关;通过Cmap分析,筛选到Vorinos-tat、15-delta prostaglandin J2、trichostatin A、tanespi mycin等8种候选药物或化合物,在进一步的实验中也证实15d-PGJ(2)可有效抑制A549细胞的增殖。结论:基于基因表达谱的途径为药物发现提供新思路,加速了药物发现过程。

基于文献挖掘的雄激素非依赖型前列腺癌特异表达基因的生物信息学分析

目的:比较雄激素依赖型与非依赖型前列腺癌的基因表达差异,加深对雄激素非依赖型前列腺癌形成的分子机制的认识,为前列腺癌防治找到新的有效手段。方法:通过FACTA工具从PubMed找出前列腺癌的相关基因进行分类,利用GATHER、PANTHER、STRING和ToppGene等在线工具对雄激素非依赖型前列腺癌特异表达基因进行生物信息学分析。结果:筛选雄激素非依赖型前列腺癌特异基因128个,这些特异表达基因在细胞信号转导、凋亡、肿瘤生成、细胞粘附、细胞增殖和分化等生物学过程起着重要作用。结论:通过生物信息学对雄激素非依赖型前列腺癌特异表达基因的挖掘发现,MMP9、EGFR、MMP2、ADM、MIF、IGFBP3、IL2、MET、BAD、RHOA、SPP1、EP300、SMAD3、RAF1、PTK2、TGFB2等基因在雄激素依赖型转变成非依赖型前列腺癌中可能起着重要作用。

弱精子症相关基因的生物信息学研究

目的:研究弱精子症特异表达基因,加深对弱精子症发生分子机制的认识。方法:采用GATHER、PANTHER以及ToppGene在线生物信息学分析工具,对弱精子症差异表达基因进行生物信息学分析挖掘。结果:通过上述生物信息学软件分析发现,弱精子症差异表达基因在细胞蛋白质及大分子生物代谢过程、蛋白修饰、细胞死亡、细胞凋亡以及凋亡介导中发挥着重要作用。结论:通过生物信息学挖掘发现弱精子症患者精子在活力下降的同时,精子的基本生命活动也下降,同时更易于发生凋亡或死亡。参与细胞骨架构成、微管运动、细胞运动的一些差异表达基因,如KIF3B、MYO15A、KIF6、KIF26B、KIF3A、DNHD2、DMN、DYNC2H1、STARD9、MYOHD1、TPM1等,可能与弱精子症相关,值得进一步深入研究。

慢性疲劳综合症差异表达基因筛选的运动实验研究

为了寻找慢性疲劳综合症的标志物,并研究慢性疲劳综合症与身体锻炼之间的关系,对患有慢性疲劳综合症女性的运动前后外周血单核细胞基因表达谱进行了研究。两组女性自愿参加本次实验(即患有慢性疲劳综合症的女性组,称为实验组;身体健康而很少参与体育锻炼的白领组,称为对照组),两组在功率自行车上进行运动,强度控制在其最大负荷的70%左右。在负荷前后抽取血液,分离单核细胞并提取总RNA,逆转录成cDNA,进行信号标记后与带有3 800个寡核苷酸片断的芯片进行杂交。结果是:在负荷前后组内、组间的基因表达都有差异;又用基因功能分类方法对差异进行了评估,实验组与对照组间的运动敏感基因表达的差异主要体现在与染色质合成、核小体、囊泡、细胞骨架以及膜蛋白受体功能有关的基因上;与离子转运和离子通道活性相关基因表达方面,两组间的基准值在运动前就有明显差异,而在运动过后其差异变得更大。