小型猪作为人类疾病动物模型在生物医学研究中的应用

与啮齿类小型实验动物模型相比,小型猪因其解剖学、生理学、疾病发生等方面与人类极为相似,且价廉、无伦理问题等方面的原因,在生物医学研究领域中具有广阔的应用前景,尤其在人类疾病动物模型制作、新药安全性评价、异种器官移植等领域应用更广。论文主要综述了国内外小型猪作为心血管疾病、消化系统疾病、皮肤烧(烫)伤、口腔疾病、异种器官移植等动物模型的制作方法及研究概况。

国内外动物福利的比较与伦理学思考

从动物福利基本理论原则出发,系统比较了国内外关于家畜、野生动物以及实验动物福利状况,并从伦理学范畴阐述人类给予动物福利不仅基于现实社会利益的驱动,更是文明的体现,道德的完善和伦理的诉求。且动物福利问题事关中国作为国际社会负责任的大国形象,标志中华民族文明程度。

普通级大动物实验设施建设体会

根据实验动物环境及设施国家标准(GB14925-2010)规定,结合公司的土建基础,综合考虑动物实验的要求,工程设计合理,施工规范。设施的各项指标均符合国家的相关标准。目前该设施总体运行良好,以下就该设施建设过程中的一些体会进行归纳。

西藏小型猪与高原藏猪的血液生理生化值的比较

目的比较西藏小型猪与高原藏猪的血液生理、生化指标的差异。方法采用全自动血液细胞和生化分析仪测定21个血液生理生化指标。结果藏猪与西藏小型猪之间,红细胞、白细胞、血小板计数、总胆固醇、血清甘油三酯指标的测定差异有显著性,谷草转氨酶、血清总蛋白、血清清蛋白、葡萄糖、肌酸激酶指标的测定差异极显著。其中红细胞、白细胞、谷草转氨酶、肌酸激酶的值藏猪高于西藏小型猪,而血小板计数、血清总蛋白、血清清蛋白、葡萄糖、总胆固醇、血清甘油三酯的值藏猪低于西藏小型猪。结论不同的生活环境、气候条件和营养水平会对动物的血液生理、生化值的测定造成一定的影响。

广州地区三种小型猪血液生理生化指标的比较

目的比较广州地区西藏小型猪、五指山小型猪和巴马小型猪血液生理生化指标的差异。方法全自动血液细胞和生化分析仪测定24个血液生理生化指标。结果 24个指标中,血红蛋白、白细胞、单核细胞、血细胞比容、葡萄糖指标的测定差异显著;淋巴细胞、中性粒细胞、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标的测定差异极显著。其中血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、血清总蛋白、血清清蛋白、血尿素氮、血肌酐指标以西藏小型猪最高,白细胞、淋巴细胞指标以五指山小型猪最高,而中性粒细胞、单核细胞、葡萄糖指标以巴马小型猪最高。结论三种小型猪血液生理生化指标的比较,为建立小型猪生物学特性数据库提供了理论依据。

苜蓿提取物的降血脂功能实验

目的建立大鼠高脂血症模型并探讨苜蓿提取物对大鼠高脂血症的影响。方法40只SD大鼠连续饲喂高脂饲料3周,测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。根据TC水平将大鼠随机分为高脂模型组和苜蓿提取物低、中、高三个剂量组,各组继续饲喂高脂饲料,各剂量组分别以0.60、1.20、3.60g/kg三个剂量灌服给予苜蓿提取物,另设空白对照组饲喂基础饲料。实验第35天,测定各组大鼠血清TC、TG、HDL-C水平,同时处死动物采集标本用于病理组织学观察。结果大鼠用高脂饲料饲喂3周后,TC、TG、HDL-C水平均升高,给予苜蓿提取物后,TC、TG、HDL-C水平降低。组织病理学观察表明高脂模型组大鼠肝脏存在严重脂肪变性,各剂量组大鼠肝脏病变减轻。结论苜蓿提取物对高脂血症大鼠具有降低TC、TG水平的作用,并可减轻高脂血症大鼠肝脏的病变程度。

四种小型猪内源性逆转录病毒基因研究

目的检测四种小型猪在内源性逆转录病毒基因(PERV)拷贝数上的差异,试图找出不含或含有较低拷贝数的个体或品种。方法采用半定量PCR方法检测了我国四种小型猪内源性逆转录病毒基因的拷贝数。结果贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221)。尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义。结论四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,表明其用于异种器官移植研究的可行性。

比格犬和人血液流变学指标的比较分析

目的探讨比格犬的血液流变学特性,并和人的血液流变性进行比较。方法采集成年比格犬和人的血液样品,分别检测其全血黏度(高、中、低切变率)、血浆黏度、红细胞比容、血沉及血浆纤维蛋白原等5项血液流变学指标。结果(1)雄性比格犬的WBV值(150s-1、1s-1)均显著低于雌性(P<0.05,P<0.05);(2)人类中,男性的WBV值(1s-1)和HCT值显著高于女性(P<0.05,P<0.01),而男性的ESR值则显著低于女性(P<0.01);(3)比格犬的血液流变学指标中WBV(1s-1)、ESR均显著低于人类(P<0.05),而PV、HCT和Fi则显著高于人类(P<0.01)。结论比格犬的血液流变学指标与人类相比相差较远。

诱导性多能干细胞研究进展

诱导性多能干细胞(iPS细胞)技术是近几年新发展起来的一种分子生物学技术,该技术采用体外导入Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4等4个转录因子可将小鼠体细胞直接重构成为ES细胞样的多潜能细胞,并命名这类细胞为诱导性多潜能干细胞(即iPS细胞)。同样转染上述因子或Oct4、Sox2、Nanog、LIN28等4个因子也能够使人类体细胞重构为iPS细胞,进一步研究表明iPS细胞具有与人类ES细胞相似的基本特征。然而,不论是作为载体的病毒,还是植入的基因都具有致癌的风险,从而限制了iPS细胞的临床应用前景。为克服iPS细胞致癌的风险,科学家们研究出了不借助病毒、安全地将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法。由此表明iPS细胞将在临床医学、再生医学和药物筛选、疾病动物模型的建立等领域中具有广阔的应用前景。

四种小型猪内源性逆转录病毒基因研究

目的检测中国四种小型猪在PERV拷贝数上的差异,试图找出不含或含有较低拷贝数的一个个体或一个品种。方法采用半定量PCR方法检测了我国四种小型猪内源性逆转录病毒基因的拷贝数。结果贵州小型猪、五指山猪、西藏小型猪、巴马小型猪的PERV的拷贝数分别是34.12±16.96,29.38±13.83,28.71±14.11,27.12±14.43(F=0.614,P=0.609),EnvA的拷贝数分别是9.78±5.48,10.06±5.34,10.23±5.71,10.51±6.23(F=0.044,P=0.988),EnvB的拷贝数分别是24.14±11.26,20.72±8.36,18.35±8.50,17.60±8.65(F=1.512,P=0.221)。尚不能认为四个猪种间PERV、EnvA、EnvB的拷贝数之间的差异具有统计学意义。结论与已报道的其它猪种相比,四种常用的小型猪内源病毒负载量较低,充分证明了其用于异种器官移植研究的可行性。

胡桃醌对人肝癌BEL-7402细胞亚显微结构的影响

目的了解胡桃醌对人肝癌BEL-7402细胞亚显微结构的影响。方法12.5μmol/L胡桃醌作用于BEL-7402细胞24h后固定,分别行HE染色、考马斯亮蓝染色、扫描电镜及透射电镜样品制备。结果12.5μmol/L胡桃醌处理组细胞形态和细胞骨架发生改变。扫描电镜结果显示BEL-7402细胞胞体体积缩小,与周围细胞群脱离,表面微绒毛卷曲、畸变、小球结构逐渐增多,细胞间连接逐渐断裂,细胞间隙增宽,有凋亡小体形成。透射电镜结果显示胡桃醌作用BEL-7402细胞24h后,细胞内质网扩大,线粒体结构疏松,胞核核仁裂解,凋亡小体形成。结论胡桃醌能有效改变人肝癌BEL-7402细胞亚显微结构,诱导细胞凋亡。

胡桃醌对血管形成的影响及其机制初探

目的:观察胡桃醌对内皮细胞系EAHY.926细胞活性和迁移性、大鼠主动脉微血管样结构和鸡胚尿囊膜血管生成的影响。方法:不同浓度胡桃醌作用于EAHY.926细胞株48 h后MTT法检测细胞存活率。大鼠主动脉无血清培养,加入100、50、25、12.5μmol/L浓度的胡桃醌,观察其对微血管结构的影响。选用7日龄鸡胚进行鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验。结果:200、100、50μmol/L浓度胡桃醌对EAHY.926细胞活性有明显的抑制作用(P<0.05),IC_(50)为122.848μmol/L;25、12.5μmol/L的胡桃醌促进EAHY.926细胞株的生长(P<0.05)。100、50、25μmol/L的胡桃醌均可抑制大鼠主动脉微血管形成(P<0.01),12.5μmol/L的胡桃醌可明显减少内皮细胞的爬行数量,延缓其爬行速度(P<0.01)。200、100、50、25μmol/L胡桃醌对鸡胚绒毛尿囊膜已存在的血管有不同程度的刺激作用,出现不同程度的充血、出血,最终凝血,且呈剂量依赖性;而12.5μmol/L的胡桃醌作用区域无新生血管形成。结论:胡桃醌具有抗血管生成作用。

胡桃醌不同给药途径对人肝癌细胞BEL-7402裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的采用裸鼠皮下移植瘤模型,通过不同给药途径对胡桃醌抗肿瘤活性和毒性进行评价。方法建立人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过腹腔注射和局部注射两个给药途径观察胡桃醌抑制肿瘤生长的效果。结果①以600、300和150μg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,发现该剂量胡桃醌对肿瘤生长没有明显的影响;NK细胞活性检测发现,600、300μg/kg胡桃醌对裸鼠免疫功能有影响(P均<0.01),150μg/kg胡桃醌则没有影响(P>0.05);与阳性对照组(5-Fu)相比,600μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异无显著性(P>0.05),300和150μg/kg胡桃醌组NK细胞活性差异有显著性(P<0.05,P<0.01),结果提示胡桃醌对小鼠免疫系统有一定的损伤作用。②以4.5、3和1.5 mg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,抑瘤率分别为为78.24%、66.57%、48.94%;4.5、3 mg/kg胡桃醌的抑瘤作用可与阳性对照组比拟(P均>0.05)。但4.5 mg/kg胡桃醌组裸鼠出现明显的皮下脂肪减少、消瘦,并有死亡现象。③以pH 7.4和pH 4.0的600、300和150μg/kg胡桃醌人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型局部给药,结果发现不同pH(pH 7.4或4.0)600、300μg/kg的胡桃醌局部注射抑瘤作用与阳性对照组(5-Fu)组差异无显著性(P>0.05),而不同pH的150μg/kg胡桃醌抑瘤作用不明显。同一浓度不同pH药物的抑瘤作用差异无显著性(P均>0.05),但pH 4.0的胡桃醌组肿瘤细胞肝转移较少。结论胡桃醌不同给药途径均可抑制人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,但有一定的毒副作用,药物安全范围较小。

戊巴比妥钠联用速眠新Ⅱ对西藏小型猪麻醉效果观察

目的观察联合应用速眠新Ⅱ和戊巴比妥钠对西藏小型猪的麻醉效果。方法采用速眠新Ⅱ（0.1mL/kg）肌内注射和3%戊巴比妥钠生理盐水溶液（0.2 mL/kg）静脉注射联合麻醉方法对15头行胚胎移植术的西藏小型猪进行麻醉,观察动物麻醉维持时间、镇痛效果、呼吸频率和心率变化及术后苏醒情况。结果80%（12头/15头）西藏小型猪初始量麻醉状态维持45 min以上,20%（3头/15头）西藏小型猪手术过程中追加麻醉。麻醉期间肌肉松弛效果好,动物呼吸和心率平稳。手术过程中西藏小型猪呼吸频率为（12-22）次/min,心率为（63-85）次/min,麻醉过程中未出现麻醉死亡,术后苏醒时间为30-60 min。结论速眠新和戊巴比妥钠混合麻醉效果好,且麻醉剂量较以往大幅减少,术后苏醒快。戊巴比妥钠联用速眠新复合麻醉对西藏小型猪是一种较理想的麻醉方法,且动物麻醉安全性高。

胡桃醌对小鼠黑色素瘤细胞B16F10体内迁移的影响

目的:研究胡桃醌对小鼠黑色素瘤细胞B16F10体内迁移的影响。方法:采用小鼠B16/F10黑色素瘤人工肺转移模型研究胡桃醌对肿瘤细胞血道转移的作用。结果:与溶剂对照组相比,4.5、3、1.5和0.75mg/kg胡桃醌组显著减少小鼠黑色素瘤B16F10血道转移(P<0.05),其抑制率分别为27.30%、55.35%、31.52%和25.34%;3mg/kg胡桃醌与阳性对照组相比,抑瘤率无统计学差异(P>0.05)。结论:胡桃醌可抑制小鼠黑色素瘤B16F10血道转移。

西藏小型猪心脏、呼吸系统组织学观察

目的积累西藏小型猪心脏和呼吸系统的组织学资料,对西藏小型猪在相关生物学研究上的应用提供参考。方法将西藏小型猪心脏和呼吸系统各脏器固定于10%中性甲醛溶液中,常规石蜡切片,HE染色,光镜下观察。结果西藏小型猪心脏壁厚,心内膜下浦肯野纤维粗,束细胞大而清晰,排列规则;心肌纤维粗大,排列紧密,横纹较模糊,润盘少且不清楚,肌间血管丰富;心外膜较厚。西藏小型猪鼻黏膜较厚;气管和支气管假复层柱状纤毛上皮排列紧密,纤毛粗而长,黏膜下腺体量少;肺支气管周围无炎性细胞浸润,肺泡腔内尘细胞极少,肺泡壁和肺间质血管较丰富。结论西藏小型猪心脏、呼吸系统表现出高原动物组织学特点,其这种特点对今后西藏小型猪实验所涉及的组织学判断有重要参考价值。

SPF级新西兰兔用于热原检查的试验探讨

目的了解SPF级和普通级新西兰兔及其不同性别之间初筛合格率的差异。方法按照《中国药典》2005年版中对热原检测的要求,对试验用兔进行测温。结果SPF级与普通级合格率、同级别间雌雄合格率间均存在显著性差异(分别为χ2=4.110,P=0.046;χ2=13.767,P=0.000;χ2=5.508,P=0.025),而不同级别雌性新西兰兔初筛合格率之间没有显著差异(χ2=1.580,P=0.259),雄性新西兰兔初筛合格率之间存在显著性差异(χ2=4.953,P=0.034)。不同级别的新西兰兔初筛体温分布存在显著差异(χ2=95.536,P=0.000)。相同实验次数,SPF级新西兰兔意外死亡率较普通级新西兰兔低(χ2=7.467,P=0.008)。结论SPF级新西兰兔初筛合格率较普通级高,雄性新西兰兔初筛合格率较雌性高。

西藏小型猪MSTN基因5'调控区的酶切多态性分析

目的对西藏小型猪MSTN基因进行PCR-RFLP基因多态性分析,并对五指山小型猪、贵州香猪和巴马小型猪进行MSTN基因多态性的比较研究。方法以42头西藏小型猪、17头五指山小型猪、7头巴马小型猪和22头贵州香猪作为研究对象,对猪MSTN基因5′调控区进行了PCR-RFLP多态性研究。结果1、不同猪种之间的基因型频率和等位基因频率有显著性差异(P=0.000),西藏小型猪的MSTN基因表现出3种基因型TT(9.52%)、AA(61.90%)、TA(28.57%),T和A的频率分别为23.81%和76.19%;五指山小型猪的MSTN基因表现出2种基因型TT(82.35%)、AA(17.65%),T和A的频率分别为82.35%和17.65%;贵州香猪的MSTN基因表现出2种基因型TT(81.82%)、TA(18.18%),T和A的频率分别为90.91%和9.09%;巴马小型猪的MSTN基因表现出2种基因型TT(71.43%)和TA(28.57%),T和A的频率为85.71%和14.29%。2、不同MSTN基因型的西藏小型猪的初生重(P=0.761)和离乳重(P=0.319)无显著性差异。结论西藏小型猪、五指山小型猪、贵州香猪和巴马小型猪的MSTN基因5'调控区存在多态性,但暂不能把MSTN基因做为西藏小型猪繁殖性能的分子标记。

西藏小型猪部分脏器血管铸型标本制作

目的研究西藏小型猪内脏铸型,对西藏小型猪在相关生物医学研究上的应用提供参考。方法应用过氯乙烯和牙托粉单独或混合填充剂灌注方法制作西藏小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑铸型研究其血管分布规律。结果西藏小型猪内脏铸型外观完整美观,保持正常解剖状态、位置,充分显示和暴露主干的分支分布,各管道饱满,管道粗细适当,标本色泽鲜艳。结论通过单独或混合灌注过氯乙烯和牙托粉填充剂可以成功制作西藏小型猪铸型标本,所做标本显示的脏器血管分布情况对相关生物医学研究具有重要应用价值。

免疫瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白对SD大鼠脂肪沉积的影响

目的原核表达瘦素受体（OBR）近跨膜区重组融合蛋白并进行SD大鼠免疫实验，观察其对SD大鼠脂肪沉积的影响。方法设计1对带有BamHI和Hindlll酶切位点特异性引物，扩增OBR胞外近跨膜区基因片段（1705～2364bp），经酶切后连接到表达载体pRSETA的BamHI和HindⅢ两酶切位点之间，构建OBR胞外近跨膜区重组表达质粒并在大肠杆菌E．coli BL21（DE3）中表达，SDS．PAGE电泳分析和western blotting鉴定表达产物。随后制备OBR胞外近跨膜区重组融合蛋白并免疫SD大鼠，观察其对SD大鼠体质量、采食量、体长、Lee’S指数、腹脂率、肝脏脂肪沉积、皮下脂肪沉积的影响。结果SDS．PAGE电泳分析和Western blotting鉴定结果显示，在IPTG诱导下OBR胞外近跨膜区重组表达菌表达了相对分子质量27600左右的融合蛋白。对SD大鼠免疫0BR胞外近跨膜区重组融合蛋白后，体质量、体长、Lee’S指数、腹脂率、肝脏脂肪沉积与对照组无明显差异，而采食量显著增加、皮下脂肪细胞体积减小。结论成功表达西藏小型猪瘦素受体胞外近跨膜区重组融合蛋白，免疫SD大鼠可促进采食和抑制皮下脂肪沉积。