甲基强的松龙与单唾液酸神经节苷脂联合治疗急性脊髓损伤

目的观察大剂量MPSS与GM-1联合使用在急性脊髓损伤神经功能恢复治疗中的有效性。方法采用随机临床观察法,将急性脊髓损伤患者分为两组,甲强龙组给予单纯大剂量甲强龙规范治疗,甲强龙+GM-1组予大剂量甲强龙24h冲击疗法后继以GM-1治疗,对伤后24h,3及6个月时患者的感觉运动神经功能进行ASIA92评分。结果受试68例患者中,用药组神经功能较用药前均有所改善,尤其MPSS+GM-1组神经功能恢复显著,且联合用药较MPSS组神经功能评分在伤后3、6个月相比分值提高有统计学显著性差异,且无不良反应。结论大剂量甲强龙冲击疗法继以GM-1治疗在急性脊髓损伤治疗中有较好疗效及安全性。

胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化(英文)

背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色。目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较。设计:对照观察。单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室。材料:选用10只清洁级孕16d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma)。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12。原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆。②对照组:在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清。③碱性成纤维细胞生长因子组。④转化生长因子β1组。⑤胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组。换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子+2μg/L转化生长因子β1。①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况。②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达。③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。主要观察指标:①各组细胞分化的形态学特点。②各组神经干细胞免疫组织化学检测结果。③各组神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化形态:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②免疫组织化学检测结果:对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组及胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③神经元及星状胶质细胞的阳性百分比:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组神经元阳性百分比高于血清对照组、碱性成纤维细胞生长因子组及转化生长因子β1组(χ2=24.15,19.56,25.32,P<0.05～0.01),星状胶质细胞阳性百分比低于血清对照组及转化生长因子β1组(χ2=24.45,23.79,P<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,说明两者具有协同作用。

胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1联合诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化特点

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1体外联合诱导对脊髓源性神经干细胞分化的影响,为了解神经干细胞在体内多因素环境下的分化表现提供实验依据。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。①碱性成纤维细胞生长因子,表皮生长因子,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白多抗,神经丝蛋白单抗(Sigma)。②选用清洁级孕16d的SD大鼠10只,无菌条件下取出胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。基础培养基组成:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02B27添加液的DMEM/F12。③原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆,在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清作为对照。同时设立碱性成纤维细胞生长因子组、转化生长因子β1组、胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组,换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子+2μg/L转化生长因子β1。观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化行为,免疫细胞化学染色标记神经元与星状胶质细胞的表达。④通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化的形态学观察:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出3种神经细胞类型:神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②神经干细胞免疫组织化学检测:血清对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组、胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③流式细胞荧光分选计数:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组神经元分化比例最高,明显高于碱性成纤维细胞生长因子组(χ2=19.56,P<0.05),而与血清对照组、转化生长因子β1组比较差异有极其显著性意义(χ2=24.15,25.32,P均<0.01)。碱性成纤维细胞生长因子组星状胶质细胞分化比例最低,胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组组与其相近(χ2=17.23,P>0.05),而血清对照组、转化生长因子β1组则显著升高(χ2=24.45,23.79,P均<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,为脊髓原位神经干细胞分化及神经干细胞移植体内后的分化表现提供了实验数据。

脊髓源星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白表达抑制最佳短发夹样RNA分子筛选及真核表达载体构建(英文)

背景:哺乳动物脊髓损伤后胶质瘢痕形成是神经再生的物理和化学屏障,减轻或延缓胶质瘢痕形成给损伤脊髓再生创造了有利条件。目的:设计筛选并构建大鼠胶质原纤维酸性蛋白短发夹样RNA真核表达载体。设计:观察性动物实验。单位:南方医科大学附属深圳医院脊柱外科。材料:选用Wistar大鼠25只,雌雄不拘,清洁级,体质量20～25g。DMEM/F12、lipofectamine2000、Trizol RNA分离试剂盒;胎牛血清(Hyclone);BamHⅠ、HindⅢ、PstI、SalI、T4连接酶;质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒;第一链cDNA合成试剂盒;兔抗鼠GFAP一抗。方法:实验于2005-10/2006-06在南方医科大学附属深圳医院完成。针对GFAP基因全编码序列设计并合成3对9bp茎环结构19bp干扰序列特异性shRNA模板,体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体;通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型,脂质体介导RNA干扰分子转染,由实时荧光定量RT-PCR及western blot技术,观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果,筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。主要观察指标:①序列特异性干扰shRNA模板合成;②构建特异性重组质粒真核表达载体;③体外大鼠脊髓源星形胶质细胞培养;④实时荧光定量RT-PCR;⑤RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果。结果:序列测定证实GFAP-shRNA重组质粒真核表达载体构建成功,通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术筛选出最佳GFAP-shRNA效应表达载体,在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81%、63%、56%。结论:构建并筛选成功的GFAP-shRNA效应真核表达载体,在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP-基因表达,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗研究策略的应用奠定前期基础。

脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制真核表达载体构建及最佳短发夹样RNA分子筛选

目的构建并筛选大鼠胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达抑制短发夹样RNA (shRNA)真核表达载体。方法针对GFAP基因全编码序列设计并合成三对9 bp茎环结构、19 bp干扰序列特异性shRNA模板,体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体;通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型,脂质体介导RNA干扰分子转染,实时荧光定量RT-PCR及Western blot技术观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果,筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。结果序列测定证实GFAP-shRNA重组质粒真核表达载体构建成功,三对shRNA模板在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81%、63%、56%。结论高效率的GFAP-shRNA真核表达载体存大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP基因表达,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗中的应用奠定了前期基础。