布鲁氏菌AP-PCR最优反应体系的建立

目的建立布鲁氏菌的随机扩增DNA多态性的优化反应体系,用于布鲁氏菌分子流行病学研究。方法利用几种随机引物及其组合(P1、P2、P3、P4、P5、OPLO4、P3/5、P4/5)进行随机引物PCR的反应(AP-PCR,又称RAPD),及重复片断引物ERIC1R/ERIC2的随机扩增多态性;另外针对优选引物P5和OPLO4,分别对Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度、引物的浓度及扩增过程中的退火温度等影响反应结果的因素,进行了一系列优化组合方案的试验及系统分析。结果引物P5、OPLO4和引物组合P4/5可以得到布鲁氏菌的高分辨率的分型带谱,并建立相应的优化反应体系。结论在严格的优化反应条件下,建立简单、快捷、灵敏度高的RAPD方法,用于布鲁氏菌的DNA多态性研究,为布鲁氏菌分子流行病学的深入研究提供资料。

湿热复合创伤应激对兔血浆胃动素的影响

目的探讨高温高湿创伤复合条件下血浆胃动素的变化规律,为研究提高部队对抗应激反应的能力提供实验依据。方法(1)常温对照组置于干球温度(24±1)℃、相对湿度(55±5)%环境2 h;(2)常温创伤组置于同样环境,以350 N的力撞击致兔右后肢股骨中下段粉碎性骨折2 h;(3)湿热无创组置于仿真模拟气候舱[干球温度(38±1)℃,相对湿度(65±5)%]2 h;(4)湿热创伤组同时施加(2)、(3)两种条件2 h。每30 m in抽取静脉血4 m l,用放射免疫法测定血浆胃动素。结果湿热、创伤应激均可引起血浆胃动素含量的升高,4组血浆胃动素的变化均有显著差异(P<0.05)。结论复合因素应激对血浆胃肠激素的影响大于单因素应激,湿热应激对胃肠激素的影响超过创伤应激,且应激刺激强度大,机体的内分泌反应出现早,而早期动态观察血浆胃动素变化,对把握干预时机、提高机体对应激的适应能力有重要意义。

中国布鲁氏菌核糖体的基因多态性

目的分析国内99株布鲁氏菌的遗传多态性,为其分型和诊断奠定基础。方法提取布鲁氏菌DNA,经内切酶Eco RI酶切、琼脂糖凝胶电泳、Southern转印后,与地高辛标记的16 srRNA核糖体基因探针杂交,以酶免疫试验检测信号,比较布鲁氏菌各标准株和野生株的16 srRNA核糖体指纹图谱。结果不同布鲁氏菌菌株在16 s rRNA探针杂交图谱上有明显的多态性,根据杂交的条带数及片段的大小差异,99株布鲁氏菌分属17个RT型(ribotype,RT型)。以RT15型为优势型,其他型别则较分散,有的RT型只存在于某个菌株。结论我国布鲁氏菌在遗传分化及克隆群的分布上存在多态性,提示国内布鲁氏菌在流行上具有复杂性。

一种制备抗复合抗原单克隆抗体的方法

目的建立通过单次细胞融合制备抗复合抗原(多种抗原)单克隆抗体的方法.方法用复合抗原(甲胎蛋白、癌胚抗原、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、乙型肝炎e抗原)免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备单克隆抗体.通过Protein-G亲和层析纯化阳性杂交瘤细胞株腹水,并通过亚类试剂盒法和非竞争ELISA法分别测定抗体亚类和亲和常数,同时应用免疫印迹分析其特异性.结果通过单次细胞融合共获得20株抗上述复合抗原的单克隆抗体,其中针对甲胎蛋白的单克隆抗体5株、针对癌胚抗原的单克隆抗体6株、针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体3株;针对乙型肝炎核心抗原的单克隆抗体4株、针对乙型肝炎e抗原的单克隆抗体3株.已鉴定的部分阳性杂交瘤细胞株亚类均为IgG1,抗体亲和常数介于1×109M-1～2.8×1011M-1,免疫印迹分析显示,所获得的单抗都与其抗原发生特异性结合.结论建立了通过单次细胞融合制备针对复合抗原的单克隆抗体制备技术,使单克隆抗体的产出率显著提高,制备周期明显缩短,为建立规模化单克隆抗体制备平台奠定基础.

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。

恶性疟原虫海南株FEN-1基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)侧翼核酸内切酶 1(FEN 1)基因序列,比较 FCC1/HN株与国外分离株FEN 1基因序列的差异。 方法 根据 FEN 1 基因已知序列设计合成 1 对引物,应用 PCR技术从 FCC1/HN株基因组DNA中扩增出FEN 1基因,构建重组质粒PMD18 T FEN 1。阳性克隆的重组质粒经酶切鉴定后进行测序。应用DNAMAN分析软件进行不同分离株FEN 1基因序列的同源性比较。 结果 PCR扩增得到特异的 FCC1/HN株FEN 1基因序列,基因全长1 947 bp,A+T含量为56%,G+C含量为44%。酶切鉴定获得了正确的PMD18 T FEN 1重组质粒。测序表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外Gambia株和3D7株的FEN 1基因序列有较高的同源性。结论 成功克隆恶性疟原虫FCC1/HN株FEN 1基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫FCC1/HN株与国外已报道各株的FEN 1基因序列有高度同源性。