体外人原代肝细胞分离与培养及冻存研究

目的通过对人原代肝细胞分离、培养、冻存,研究冻存前后肝细胞的形态功能,以期为生物人工肝、肝细胞移植的研究及应用提供细胞来源。方法采用多点穿刺两步灌流法分离原代肝细胞,体外预培养24 h,经程序降温盒冷冻法短期冻存。复苏后对细胞的活力、形态、微生物污染及相关功能基因表达进行测定。结果复苏后,肝细胞存活率达到(71.6±2.2)%,相较新鲜分离的肝细胞,存活率达到90%以上,体外培养时间长达12天,无微生物污染,复苏前后白蛋白(ALB)、谷氨酰胺合成酶(GS)、氨甲酰磷酸合酶1(CPS1)以及细胞色素酶P450 3A4(CYP3A4)功能基因表达无统计学差异(P>0.05)。结论初步建立了人原代肝细胞分离、培养、冻存方法,为生物人工肝及相关肝细胞治疗奠定了研究基础。

用于药物研发的细胞色素P450酶3A4体外肝细胞模型的研究进展

药物研发中生理性功能的体外细胞模型是非常重要的。细胞色素P450酶3A4(CYP3A4)是最重要的临床药物代谢酶之一,其作用底物谱广泛。相应地由这些底物作用于CYP3A4酶而产生的酶活性被抑制或诱导,直观表现为复杂化的药物代谢相互作用。因此,CYP3A4体外细胞模型在药物研发过程中具有重要应用价值。目前常用CYP3A4表达的一些体外模型,相比体内有不同程度的差距。这些差距有望通过加深机制了解、基因工程学技术以及体外微环境模拟功能单元构建组织工程技术的进步,而逐步得以缩减或消除。如何构建接近生理性表达的体外CYP3A4细胞模型是本研究领域一直探索的热点。本文就目前已知的CYP3A4生理功能特征、表达调控机制以及基于已知相关机制研究进行体外细胞模型构建的细胞种类、构建策略和方式进行综述。

人源性肝小鼠模型及其在药物代谢及肝毒性研究中的应用

人源化肝小鼠模型是一种以人肝细胞取代小鼠肝细胞的嵌合小鼠,在过去的二十年里,人源化肝小鼠模型在品质、生产能力和实用性方面有了很大的发展,已经被广泛用于多个领域,包括肝炎病毒研究、药物代谢、干细胞生物学等。临床药物的开发是一个漫长而高成本的过程,近90%的化合物在临床试验期间被宣告失败,其中肝毒性是主要原因之一。预测人体药物代谢和肝毒性是药物开发的关键。人源化小鼠模型被认为是可以模拟药物在人类体内的代谢情况,可以很好的解决物种差异问题。本篇综述描述了人源化肝小鼠模型在药物代谢及肝毒性研究中的应用、存在的问题和未来的研究方向。

在线微载体肝细胞荧光示踪研究

目的拟探讨SYTO/EB在微载体细胞培养中活体细胞原位示踪的应用价值。方法采用活细胞核酸染色剂(SYTO13)和溴化乙啶(EB)2种核酸染色剂对微载体生长的细胞进行双重染色,荧光显微镜下通过颜色不同判断细胞的活力状态并计算出活力百分比。以间接活力测定的四氮唑盐法同时对肝细胞进行活力的检测,并将结果进行比较。结果 2种方法测定的结果均可显示微载体生长的肝细胞。但SYTO/EB法更灵敏,可精确计数。结论 SYTO/EB测定微载体肝细胞的活力快速、灵敏且简便,并可原位观察细胞的活力,不失为一种可取的微载体活力检测方法。

胶原蛋白覆层聚酯纤维支架材料对模拟人肝衰竭血清成分的吸附作用

目的通过构建胶原蛋白覆层聚酯纤维支架材料,评估其对模拟肝衰竭血清成分的吸附性能,以期为人工肝吸附材料来源提供新的思路。方法通过在高分子聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)表面进行羧基化预处理、EDC/NHS活化、交联及Ⅰ型胶原蛋白偶联等序贯性处理,构建了胶原蛋白覆层的聚酯纤维支架材料PET-COL。对覆层前后的材料进行傅里叶红外光谱、BET比表面积、水接触角测定,并基于模拟人肝衰竭血清,评估材料对白蛋白、直接胆红素、总胆红素、血氨的吸附效果。结果傅里叶红外光谱显示,胶原蛋白已被共价连接至PET材料。与改性前的PET-N材料相比,胶原蛋白覆层后,PET-COL亲水性得到了显著改善(P<0.001),比表面积从0.52 m^(2)/g增加为0.63 m^(2)/g。进一步对材料改性后的吸附性能进行评估,结果显示,PET-COL对模拟肝衰竭血清的总胆红素、间接胆红素和血氨的吸附效果显著优于改性前(P<0.05)。PET-COL和PET-N对白蛋白几乎没有吸附作用,且组间比较无显著性差异(P>0.05)。结论胶原蛋白覆层后,可以提高PET-COL对模拟肝衰竭血清成分的吸附性能,为血液净化吸附材料的来源提供了一个新的思路。

模拟失重与骨组织的细胞凋亡

背景:空间骨丢失主要表现为成骨细胞、骨细胞活性减弱,而包括Fas蛋白在内的诸多因素可调节成骨细胞、骨细胞的增殖和分化并最终调控骨形成。目的:观察失重对骨组织中细胞凋亡的影响。方法:5周龄SPF级雄性SD大鼠36只,随机分为尾吊模拟失重组及对照组。建立大鼠尾吊模拟失重模型,建模后7,14,21d,使用自动生化仪检测大鼠血清中钙、磷、碱性磷酸酶含量,放射免疫分析法测定骨钙素含量,原位细胞凋亡检测技术检测骨组织中细胞凋亡,免疫组化方法检测骨组织中Fas蛋白含量。结果与结论:尾吊模拟失重组大鼠血清中碱性磷酸酶、骨钙素含量均显著低于对照组(P<0.05),但血钙、磷浓度均较相应对照组升高,骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡指数、骨组织中Fas抗原含量均高于相应对照组(P<0.01)。说明尾部悬吊模拟失重增加骨组织中Fas蛋白表达,从而增加大鼠骨组织中成骨细胞、骨细胞及骨髓间充质细胞凋亡。

载脂蛋白E基因敲除模型小鼠转化生长因子β1表达与尼古丁的刺激

背景:研究表明尼古丁可以诱导动脉粥样硬化,但其具体作用机制尚不明确。目的:探讨不同剂量尼古丁刺激下,载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉粥样斑块形成与外周血转化生长因子β1水平的关系。方法:载脂蛋白E基因敲除小鼠腹膜下注射2种不同剂量的尼古丁[2mg/(kg·d)及0.5mg/(kg·d)]12周,对照组注射等量生理盐水。用ELISA法检测外周血转化生长因子β1水平,苏木精-伊红染色观察动脉粥样斑块的病理变化。结果与结论:尼古丁干预12周后,低剂量尼古丁组的外周血转化生长因子β1水平低于对照组(P<0.05),高剂量尼古丁组的外周血转化生长因子β1水平低于对照组及低剂量尼古丁组(P<0.05)。高剂量尼古丁组的血管狭窄程度最严重,低剂量尼古丁组次之,对照组最低,各组间比较差异均具有显著性意义(P<0.05)。低剂量尼古丁组及高剂量尼古丁组的斑块个数多于对照组(P<0.05),高剂量尼古丁组的斑块个数与低剂量尼古丁组比较差异无显著性意义(P>0.05);血管狭窄率与转化生长因子β1水平呈负相关(r=-0.920,P=0.000)。结果提示尼古丁刺激增加载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块数量,这种作用可能与尼古丁抑制转化生长因子β1水平相关。

亚抑制浓度庆大霉素通过抑制ATP的产生降低大肠杆菌丛动能力的机制

目的前期研究发现,大肠杆菌经亚抑制浓度的庆大霉素预处理后,丛动性可显著降低,本研究将基于前期的工作基础,探讨亚抑制浓度的庆大霉素对大肠杆菌丛动性的抑制作用的相关机制。方法确认亚抑制浓度庆大霉素预处理对大肠杆菌ATCC25922丛动性的抑制作用,Real-timePCR测定庆大霉素对三羧酸循环(TCA)相关基因的表达水平的影响,ATP检测试剂盒检测庆大霉素对ATP产生的影响,并观察在丛动平板中补充ATP对庆大霉素预处理大肠杆菌丛动性的逆转作用。结果1/2 MIC庆大霉素预处理可显著抑制大肠杆菌ATCC25922的丛动能力,Real-time PCR结果提示经庆大霉素处理的大肠杆菌TCA相关基因,poxB、aceE、gltA、sdhD、sdhC、sucC、fumA及icd基因表达均下调,细菌ATP产生减少,在丛动平板中补充ATP可逆转庆大霉素对大肠杆菌丛动性的抑制作用。结论亚抑制浓度庆大霉素可通过下调TCA相关基因,减少细菌ATP的产生,抑制大肠杆菌的丛动能力。该结果为进一步揭示庆大霉素的抗生素后效应发生机制提供了新的理论依据。

模拟构建人肝衰竭血清对体外培养肝细胞功能的影响

背景:生物人工肝核心材料为肝细胞,其功能好坏直接影响临床效果。目的:模拟构建一种能够和肝衰竭血清对体外培养肝细胞具有相同生物学效应的组合物。方法:观察和对比模拟肝衰竭血清、人肝衰竭血清和体积分数10%胎牛血清对培养的CL-1细胞形态学和细胞活力的变化,检测CL-1细胞酶包括乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶及谷胱甘肽的分泌量。结果与结论:模拟肝衰竭血清和人肝衰竭血清对培养的CL-1细胞活力,乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和谷胱甘肽的分泌量的影响差异无显著性意义(P>0.05),CL-1细胞的生长均受到抑制,体积分数10%胎牛血清细胞功能良好。结果提示,模拟肝衰竭血清组合物与人肝衰竭血清对CL-1细胞的生物学效应基本相同。

表面改性PET网状纤维支架材料制备及其生物安全性评价

以氨气作为等离子体气体,对合成高分子聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)支架材料表面进行低温等离子体处理,获得了一种亲水性和生物相容性得到改善的网状纤维支架材料PET-LTPT。通过XPS光电子能谱仪、水接触角、电镜、BET比表面积测定对材料进行物理化学表征,同时培养肝细胞测定其生物相容性,并对其开展体外细胞毒性、皮内反应试验以及皮肤致敏试验以评估其生物安全性。结果表明,低温等离子体处理后,PET材料引入了N元素,含量为2.38wt%,亲水性得到了显著改善(P<0.001),比表面积为0.37 m^(2)/g。PET-LTPT生物安全性良好,人肝癌细胞C3A细胞在处理后的PET-LTPT材料上实现黏附和增殖,证明了表面改性PET网状纤维支架材料用于生物人工肝用肝组织化三维培养具有可行性。

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300 ng/ml)刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义(P<0.05);此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.675)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。

多种方法去除人肝癌细胞系C3A支原体污染效果及比较

目的：通过对多种支原体污染去除方法治疗效果进行比较,找到适于人肝癌细胞系C3A去除支原体污染的最佳处理方法。方法通过聚合酶链反应（ PCR）检测C3A细胞培养物中支原体污染,并采用环丙沙星、加温处理、商品化支原体清除剂Plasmocure、人原代巨噬细胞体外共培养等方法对支原体污染样本进行处理,透射电镜（ TEM）和实时荧光定量PCR（ Q-PCR）对Plasmocure处理前后的细胞形态和基因表达进行比较分析。结果 Plasmocure成功清除支原体且无复发,环丙沙星清除支原体后复发,加温处理、巨噬细胞共培养法导致细胞死亡清除失败；电镜观察Plasmocure处理后细胞无支原体,生长良好,ALB、TF、CYP3A4表达较污染组明显增高（P〈0.01）。结论 Plas-mocure是支原体污染的有效处理方法并且能显著恢复细胞形态及基因表达。

聚乙烯醇/牛Ⅰ型胶原支架材料的制备及评价

研究了一种聚乙烯醇(PVA)和胶原(COL)复合支架材料的制备方法。采用氨基硅烷对PVA海绵表面进行了氨基化修饰后,通过戊二醛溶液交联牛Ⅰ型胶原(COL),最后通过赖氨酸溶液封闭,获得一种PVA/COL复合支架材料。采用扫描电镜(SEM)、X光电子能谱仪(XPS)、傅里叶红外光谱(FT-IR)等手段对支架材料的理化性能进行表征,并通过细胞实验对支架材料的生物学性能进行评价。结果表明,经过COL修饰的PVA孔隙率为21.33%,平均孔径为168.68mm且均匀分布,支架材料接触角为20.03°。对支架材料的生物学评价结果表明C3A细胞在复合材料上黏附良好,优于PVA组;CCK-8增殖检测结果表明细胞在复合材料上呈增殖生长趋势,与对照组PVA相比差异显著(P<0.01)。将PVA和COL复合制备得到的支架材料具有良好的理化及生物学特性,具有广阔的应用前景。

临床肝胆疾病相关的胆管反应及其意义

胆管反应是一种对肝胆细胞损伤的修复反应，特征病理变化包括小叶间胆管增生、基质变化和炎症细胞浸润。人体肝脏的胆管反应源于肝祖细胞的活化增殖。活化的肝祖细胞、中间型肝胆细胞和反应性小胆管细胞共同组成胆管反应的细胞复合体，该细胞复合体具有肝胆系双重特征，共表达肝细胞和胆管细胞抗原。胆管反应出现在各种急慢性肝胆损伤中，在肝脏再生修复、肝脏纤维化发生和发展、肝硬化形成，以及肝胆管癌的发生和发展中均有重要参与作用。了解胆管反应在各种临床肝胆疾病中的病理学特征、发生和发展机制，及其在肝再生中的作用，可以为进一步发掘肝脏疾病靶向治疗的新途径提供重要参考。

巨大肝癌破裂出血转化切除策略初步探讨

目的探讨巨大肝细胞癌(肝癌)破裂出血转化切除策略。方法回顾性分析2018年11月南方医科大学附属珠江医院收治的1例巨大肝癌破裂出血患者临床资料。患者男,56岁,因右上腹隐痛2周入院。既往有乙型病毒性肝炎病史20余年。体检:上腹膨隆,右上腹触及肿物,下缘达肋下三指。AFP 3433μg/L。CT检查示:肝左内叶内可见大块低密度影。初步诊断:原发性肝癌。患者签署知情同意书,符合医学伦理学规定。观察患者诊疗策略和疗效。结果入院后发生肝癌破裂,急诊行经导管血管栓塞术(TAE)治疗。然后予TACE+分子靶向药物降期转化治疗3个月。TAE术后16周采用三维可视化技术评估发现肿瘤明显缩小,遂行肝癌切除术,将肝左叶肿瘤完整切除,肝右叶肿瘤在术中超声引导下采用Habib射频消融。术后病理诊断为G2期肝细胞癌,未见脉管和神经侵犯。术后改服仑伐替尼,并辅以槐耳颗粒。截止投稿日期,患者存活超23个月。结论巨大肝癌破裂出血患者采用TAE联合分子靶向药物等多种治疗方式,肿瘤转化降期后二期手术切除,仍可改善生存质量。