壳聚糖纳米基因载体的制备和鉴定

目的制备载基因壳聚糖纳米粒,研究纳米粒的结构特征以及对细胞的基因转染效率。方法用表达绿色荧光蛋白的质粒(pGFP)作报告基因,采用复凝聚法制备壳聚糖-pGFP纳米粒。琼脂糖凝胶电泳分析壳聚糖和pDNA的结合能力,通过比色法检测其包封率,用纳米粒度仪和原子力显微镜对纳米粒的形态和粒径分布进行考察;通过荧光显微镜观察壳聚糖纳米粒介导pGFP在体外培养的人结肠腺癌细胞LoVo中的表达。结果琼脂糖凝胶电泳分析结果表明,pDNA与壳聚糖之间通过静电作用而完全结合,包封率大于90%。制备的壳聚糖-pGFP纳米粒为结构紧密的不规则球形,平均粒径为209nm,多分散指数为0.15。体外细胞转染的结果表明,壳聚糖-pGFP纳米粒能介导pGFP转染LoVo细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白。结论壳聚糖可以有效凝聚pDNA,采用复凝聚法可制得100￣500nm范围荷正电的纳米粒,有较高的包封率。壳聚糖纳米粒在体外能将基因递送到细胞内,并且报告基因能在细胞内表达。因此,壳聚糖作为非病毒基因载体具有介导核酸类生物大分子的应用价值。

siRNA分子的生物体内给药系统

小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA)能特异性地沉默靶基因的表达,具有治疗某些基因异常引起的疾病的应用前景。但是siRNA分子在生物体内应用时存在很多缺陷,要发挥其疾病治疗作用,就必需对其进行稳定性结构修饰并设计合适的生物体内给药系统。

靶向VEGFR2基因的siRNA分子血清稳定性及其基因沉默效应

目的设计并合成抗小鼠VEGFR2基因的siRNA分子(siVEGFR2),研究其血清稳定性和基因沉默效应,以便进一步研究经组织靶向性结构修饰后该siRNA分子的特性。方法设计并合成抗小鼠VEGFR2基因的siRNA分子,在37℃条件下与新鲜血清共孵育24h,不同时间点后取样电泳观察其完整性;用脂质体介导转染体外培养的MS1细胞,通过半定量RT-PCR分析基因沉默效果。结果随着孵育时间延长,未经修饰的siVEGFR2分子在血清中逐渐降解;经siVEGFR2转染的MS1细胞中,VEGFR2mRNA的表达水平明显下降,与空白转染组和对照siRNA转染组相比有显著差异(P<0.001),而空白转染组和对照siRNA转染组间比较无显著性差异(P=0.157)。结论裸siVEGFR2分子在血清中容易降解,siVEGFR2能特异性沉默靶基因的表达,为下一步体内应用siVEGFR2分子时稳定性修饰的必要性提供了理论依据。

聚乙烯亚胺介导siRNA分子体内外基因沉默VEGFR2表达

应用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)包裹靶向小鼠VEGFR2基因的siRNA分子,以研究其体外基因沉默作用及不同给药途径的肿瘤生长抑制作用。采用共聚焦显微镜观察荧光染料CY3标记的siRNA分子的细胞内定位,RT-PCR和Western blotting检测VEGFR2mRNA和蛋白表达水平基因沉默效果,建立裸鼠皮下肿瘤模型比较经瘤内和尾静脉给予siVEGFR2/PEI抑制肿瘤生长的作用。共聚焦显微镜观察证实PEI能成功转染siRNA分子进入细胞质,siVEGFR2/PEI转染的MS1细胞中VEGFR2mRNA和蛋白表达水平明显下降,沉默效率分别为28.2%和23.6%。瘤内给与siVEGFR2/PEI组裸鼠肿瘤体积[(189.429±17.562)mm3]明显小于空白组[(365.844±20.713)mm3]和PEI静脉给药组[(315.507±20.491)mm3]。结果表明,PEI能有效介导siRNA分子转染进入细胞质并能特异性沉默靶基因的表达。未经组织靶向性修饰的PEI不具有肿瘤靶向作用,瘤内注射的抗肿瘤效应优于静脉给药途径,这为进一步研究PEI介导的siRNA分子体内基因沉默效应的机制和优化该给药系统临床治疗肿瘤应用奠定了基础。

基因重组BDNF蛋白在大肠杆菌中的表达纯化与功能鉴定

目的构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,以获取高产量、低成本、高纯度且具有生物学活性的BDNF蛋白。方法以人的全长BDNFcDNA为模板,用PCR方法扩增成熟区BDNF的cDNA,应用基因重组技术将人BDNFcDNA克隆到质粒pET-30a(+)中,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,经IPTG诱导表达后,用Ni-NTA亲和层析纯化获取蛋白,用SDS-PAGE和westernblot方法鉴别,噻唑蓝(MTT)法检测重组蛋白对PC12细胞增殖的影响。结果扩增出的人BDNFcDNA片段克隆进了原核表达载体,经酶切和核酸测序鉴定,得到了正确的重组质粒pET-BDNF,并在大肠杆菌中获得了表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带;用抗BDNF的抗体进行westernblot分析证明目的蛋白获得了表达。基因重组BDNF蛋白能够促进PC12细胞增殖。结论本研究成功构建了表达基因重组人BDNF的原核表达载体,基因重组人BDNF蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,所获得的基因重组蛋白具有较好的生物学活性。

胚胎干细胞标记及其体内生物药剂学特点

胚胎干细胞的多潜能性分化特点和无限的自我更新能力使其成为再生药物,一直处于人类生命科学研究的前沿。近年来,应用胚胎干细胞治疗疾病的研究报道屡见不鲜,但关于其体内组织分布和代谢动力学特点等相关问题还没有系统设计的研究报道,而这些问题是实现胚胎干细胞应用于临床治疗疾病所必须解决的。本文综述了胚胎干细胞体内应用后的生物药剂学特点,并比较了各种标记示踪方法的优缺点。

脑源性神经营养因子融合蛋白对大鼠局灶性脑缺血治疗作用的初步研究

目的研究脑源性神经营养因子融合蛋白（BDNF-PTD）在大鼠脑缺血模型中对大脑神经元的保护作用。方法SD大鼠采用随机数字表法分为给药模型组、空白模型组、阴性对照组、正常组，每组5只。前3组大鼠通过线栓法制作脑中动脉栓塞模型；正常组大鼠正常喂养，不做任何处理。栓塞1h后给药模型组腹腔注射50ug（50ug／mL）BDNF—PTD。阴性对照组注射1mL生理盐水，空白模型组不做处理。采用Bederson评分评价各组大鼠神经功能缺损情况。24h后将各组大鼠断头取脑，大脑切片TTC染色，观察各组大鼠脑梗死面积。结果给药模型组大鼠神经功能缺损不明显，Bederson评分明显低于空白模型组及阴性对照组（P〈0．05）。TTC染色结果提示给药模型组大鼠脑梗死区域面积较空白模型组、阴性对照组明显缩小，差异有统计学意义（p〈0．05）。结论BDNF-PTD能通过血脑屏障并且发挥其生物学效应，起到保护脑缺血后神经元作用。

BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及脑中分布

目的在大肠杆菌中表达并纯化BDNF．TAT融合蛋白，研究其靶向性及在脑中的分布。方法重组质粒PET-30（a）-BDNF—TAT转染至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中，IPTG诱导其表达后用SP-Sepharose阳离子交换柱纯化，纯化后蛋白用0．4m01／L精氨酸倍比稀释法复性。KM种小鼠采用随机数字表法分为给药组[尾静脉注射复性后BDNF．TAT融合蛋白4μg（适量生理盐水溶解）1、阴性对照组（尾静脉注射等体积生理盐水）和空白对照组（不进行任何处理），每组各3只。3h后提取小鼠脑组织全蛋白．Western blotting检测脑组织中BDNF-TAT表达，SABC免疫组化染色观察BDNF—TAT在脑组织中的分布。结果获得纯度约90％活性的BDNF—TAT融合蛋白。给药组BDNF-TAT蛋白的相对表达量为1．897±0．286，阴性对照组BDNF—TAT蛋白的相对表达量为0．615±0．234。空白对照组BDNF—TAT蛋白的相对表达量为0．335±0．154，比较差异有统计学意义（F=39．019，P=0．000）。免疫组化染色结果显示给药组BDNF-TAT主要分布于小鼠脑组织海马CA1、CA3和DG区．而阴性对照组和空白对照组中没有明显阳性染色。结论BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达，并能通过外周给药靶向至小鼠脑组织。

siRNA分子非病毒载体的生物体内给药系统

目的综述小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)经非病毒载体介导生物体内给药的研究进展。方法查阅国内外相关文献,进行分析、归纳和综述。结果与结论siRNA分子由于其本身的特性,生物体内给药必须借助合适的给药系统,相对病毒载体,非病毒载体具有简便,安全和毒性小等特点,易于为临床所接受,因而近年来发展迅速。