人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯复合生物敷料对大鼠烧伤创面修复作用的实验研究

目的以人发角蛋白-胶原海绵为敷料内层,复合包裹药物虎杖的聚甲基丙烯酸羟乙酯载体,制备一种双层复合生物材料,研究其对烧伤创面的促愈合作用,探讨将其作为烧伤敷料的可行性。方法(1)将在体内具有慢(Z)、中(B)、快(F)三种吸收速度的人发角蛋白组分材料编织成网孔为1mm×1mm的网格,与从牛跟腱中抽提I型胶原溶液混合后放入模具,经真空冷冻干燥后制成海绵状膜(作复合内层敷料),扫描电镜观察其结构。(2)用聚合法制备聚甲基丙烯酸羟乙酯,再与药物虎杖一同成膜,制备药物缓释载体膜(作复合外层敷料),紫外光谱仪测定其释药度。(3)用SD大鼠制备深Ⅱ°烧伤动物模型,并于烧伤后2～5d内清除坏死组织,保留部分变性真皮组织。清创后将用与创面相同大小的人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯复合敷料覆盖创面,已用于临床的戊二醛猪皮作为阳性对照组。术后以创面完全上皮化为标准,记录创面愈合时间并分别计算第7、14、21天愈合率。(4)分别于覆敷料后1、2、4、6、8周切取整个创面及其周围组织(每组每个时间点取6个标本),行光学显微镜观察和免疫组织化学染色观察,作3组的愈合时间及第7、14、21天的愈合率比较。结果胶原海绵膜为孔径为50～300μm的三维立体状结构。经测定在0～48h内药物虎杖从聚甲基丙烯酸羟乙酯膜内不断释出。深Ⅱ°烧伤治疗实验结果:实验组创面覆盖后渗出明显减少且保持一定湿度,而对照组创面较干燥;实验组及阳性对照组的创面愈合时间较阴性对照组提前;创面在第7、14、21天的愈合率均较阴性对照组高,且实验组在第14天的愈合率较阳性对照组高。结论人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯/虎杖复合生物敷料可促进深Ⅱo烧伤实验大鼠创面的愈合,起到在体内构建组织工程化皮肤的目的。通过控制合成工艺,聚甲基丙烯酸羟乙酯膜作为药物缓释载体是可行的。

一种新型真皮替代物——人发角蛋白-胶原海绵的制备及其生物活性研究(英文)

目的制备一种人发角蛋白-胶原海绵的三维立体多孔状结构材料,探讨将其作为真皮替代物的可行性。方法将人发在体内具有慢(Z)、中(B)、快(F)三种吸收速度的HHK组分材料编织成网孔为1 mm×1 mm的网格,以酸溶法从牛跟腱中抽提胶原原液,用离心、盐析、透析等方法制备Ⅰ型胶原蛋白溶液,向溶液中滴加胶原总量8％的6-硫酸软骨素(6-GAG)进行初交联。制备好的Ⅰ型胶原溶液与HHK网格混合后放入模具,真空冷冻干燥成海绵状膜,于0．25%戊二醛溶液中浸泡再交联。将制备好的HHK-胶原海绵膜切块(1 cm×1 cm)移植于21只大鼠的真皮与皮下组织之间(实验组),并与单纯胶原海绵膜组(阴性对照)、单纯全层皮肤切开组(空白对照)作对照。于术后3 d和1、2、4、6、8、12周7 个不同时间点取材料及其周围组织,行石蜡切片的HE染色、醛复红弹性纤维染色观察及扫描电镜观察检测其组织相容性、血管化能力及材料的体内降解情况。结果人发角蛋白呈棕黄色细丝状。胶原海绵膜为微黄色。半透明状,孔径为 50至300μm的三维立体状结构。皮下移植后3 d,各组均表现为中度炎症反应,以中性粒细胞和单核细胞为主。术后1 周,炎症反应稍减轻,材料周围可见少量成纤维细胞及新生血管,实验组较对照组明显。术后2周,实验组及阴性对照组,炎性细胞中巨噬细胞增多,实验组成纤维细胞增生活跃,分泌少量胶原物,材料周围新生血管数量增多。HHK及胶原海绵开始降解,创口表皮细胞增殖移行。电镜下可见实验组材料周围包绕的胶原纤维和弹性纤维,人发角蛋白毛小皮降解、剥离;术后4周,成纤维细胞分泌大量粗大的胶原物。创口的表皮细胞增殖移行明显,实验组基本愈合。两种材料崩解明显,胶原海绵网孔内可见巨噬细胞侵入及少量小血管长入。醛复红弹性纤维染色可见短棒或细长条状弹性纤维; 术后6至8周,成纤维细胞数量相对减少,分泌胶原物融合成均质粗大,实验组其排列趋于整齐,表皮层愈合良好。人发角蛋白材料中部出现降解裂隙,胶原海绵基本降解完全。实验组醛复红弹性纤维染色可见细长条状弹性纤维;术后12 周,人发角蛋白材料降解完全。结论人发角蛋白-胶原海绵膜是物理及生物学性能良好的材料,其组织相容性好,血管化能力强,能刺激细胞增殖,促进受损皮肤愈合,可作为真皮替代物。

复合生物敷料人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯对大鼠烧伤创面的治疗作用(英文)

背景:作者在对人发角蛋白的机制研究和临床应用中提出了一个全新的组织工程学概念--在体/原位组织工程。在该理论的指导下,拟以人发角蛋白-胶原海绵为支架,复合一种可作为药物缓释载体的聚甲基丙烯酸羟乙酯,探讨其在体内原位诱导周围组织细胞构建真皮的可行性。目的:以人发角蛋白-胶原海绵为敷料内层,复合包裹药物虎杖的聚甲基丙烯酸羟乙酯载体,制备一种双层复合生物材料,观察其对烧伤创面的促愈合作用。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-03/12在南方医科大学组胚教研室完成。材料:选用雄性SD大鼠15只制备烧伤动物模型,将模型鼠完全随机分为3组:实验组,阳性对照组及阴性对照组。方法:①将在体内具有慢、中、快3种吸收速度的人发角蛋白组分材料编织成网孔为1mm×1mm的网格,与从牛跟腱中抽提Ⅰ型胶原溶液混合后放入模具,经真空冷冻干燥后制成海绵状膜(作复合内层敷料)。②用聚合法制备聚甲基丙烯酸羟乙酯,再与药物虎杖一同成膜,制备药物缓释载体膜(作复合外层敷料)。③用SD大鼠制备深Ⅱ度烧伤动物模型,烧伤后3d做清创处理,清创后实验组用与创面相同大小的人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯复合敷料覆盖创面,阳性对照组用戊二醛猪皮覆盖创面,阴性对照组为单纯无菌纱布覆盖。主要观察指标:①术后以创面完全上皮化为标准,记录创面愈合时间并分别计算7,14,21d愈合率。②于覆敷料后1,2,4,6,8周切取整个创面及其周围组织,光学显微镜观察肉牙组织生长情况和免疫组织化学染色观察新生组织中的胶原纤维和弹性纤维形态。结果:①实验组创面覆盖后渗出明显减少且保持一定湿度,而阳性对照组创面较干燥;实验组及阳性对照组的创面愈合时间较阴性对照组提前(P=0.000);创面在7,14,21d的愈合率均较阴性对照组高(P=0.000),且实验组在14d的愈合率较阳性对照组高(P<0.05)。②覆敷料后2周,光镜下观察可见创面肉芽组织中有较细小的胶原纤维填充创面。实验组较其他2组明显。胶原蛋白及弹性蛋白的免疫组织化学染色显示:第2周,实验组创面真皮基质中,Ⅰ型胶原呈棕黄色细密条带状;且有少量被染成棕黄色细丝状的弹性纤维,阳性对照组不明显,而阴性对照组中弹性蛋白无阳性表达。第8周,3组创面均愈合良好。实验组及阳性对照组胶原纤维束改造塑形,无瘢痕形成趋势。阴性对照组真皮层组织排列紊乱。结论:人发角蛋白-胶原海绵-聚甲基丙烯酸羟乙酯/虎杖复合生物敷料可促进深Ⅱ度烧伤实验大鼠创面的愈合。

丙泊酚麻醉对急性颅脑外伤手术患者血清S100B的影响

目的研究急性颅脑外伤手术前和手术期间丙泊酚对血清S100B的影响,以评价丙泊酚的脑保护作用。方法急症颅脑外伤手术患者30例。随机分为丙泊酚(A)组和异氟醚(B)组,每组15例。另10例泌尿系统手术的非颅脑损伤患者的血清作空白对照(C)组。酶联免疫吸附法测定C组及A、B组颅脑手术前、手术开始2h、手术结束时血清S100B含量。对急症颅脑外伤手术患者进行格拉斯哥(Glasgow)评分。结果A、B组患者手术前S100B显著高于C组(P<0·01);Glasgow评分越低的患者术前S100B越高(r=-0.446,P<0·05)。手术结束时A组S100B显著低于B组(P<0·05)。开颅手术2h和手术结束时两组S100B均较术前有升高。结论急性颅脑外伤时患者血清S100B升高,Glasgow评分越低,血清的S100B浓度也越高。提示临床剂量丙泊酚可以抑制血清S100B的升高,减轻继发性脑损害,具有脑保护作用。

人P58.1重组逆转录病毒载体的构建及其在淋巴细胞中的表达

目的构建人P58.1基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在淋巴细胞中的表达。方法由逆转录病毒载体pMSCV介导,将白血病受者的P58.1基因导入健康供者的淋巴细胞中,并用逆转录聚合酶链式反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果测序及BglⅡ、EcoRⅠ双酶切鉴定证实,获得了P58.1基因且已正确插入载体pMSCV。流式细胞仪检测空载体、未转染及重组pMSCV转染供者淋巴细胞的P58.1分子表达率差异有显著性,重组逆转录病毒感染的供者淋巴细胞整合了受者的P58.1基因,且能转录为相应的mRNA并在细胞膜上有P58.1分子表达。结论成功获得P58.1基因并构建重组逆转录病毒载体,该基因已稳定整合入淋巴细胞的基因组中,且获得了表达。

地塞米松对成骨细胞中mac25基因表达的调节

目的:探讨糖皮质激素地塞米松在骨代谢过程中对成骨细胞mac25基因表达的产物胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1的调节作用。方法:实验于2004-01/09在仲恺农业技术学院生理生化教研室实验室完成。选择新生24h的SD大鼠8只,雌雄各半,麻醉后切取颅盖骨,剥离骨膜后,用磷酸盐缓冲液漂洗后剪成1mm×1mm×1mm大小的骨块,体外培养成骨细胞,1周后传代接种于96孔培养板上。将培养的成骨细胞分为两组,实验组成骨细胞与地塞米松共同培养,地塞米松在培养液中的浓度为10-7mol/L;对照组成骨细胞则应用Dulbecco’s的改良的Eagle’s培养基常规培养。培养2周后提取总RNA进行半定量反转录聚合酶链反应分析及琼脂糖凝胶电泳,比较两组成骨细胞中mac25mRNA的表达水平。结果:实验组成骨细胞中mac25mRNA的表达水平显著高于对照组犤2.31±0.12,1.16±0.11,(t=2.671,P<0.01)犦。结论:糖皮质激素能在转录水平上增强成骨细胞中mac25/胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1的表达,骨微环境中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1水平的升高可阻断胰岛素样生长因子Ⅰ、胰岛素样生长因子Ⅱ与胰岛素的作用,这可能是糖皮质激素抑制骨形成的原因之一。

地塞米松对骨髓基质细胞中骨保护素与核因子кB活化受体配体基因表达的干预作用

目的:观察应用地塞米松后骨髓基质细胞中骨保护素与核因子кB活化受体配体基因表达水平的变化,并探讨地塞米松对骨代谢的影响。方法:实验于2004-01/09在仲恺农业技术学院生理生化教研室实验室完成。选择雄性6周龄SD大鼠4只,抽取大鼠股骨骨髓,使用密度梯度离心分离有核细胞,贴壁分离法获取骨髓基质细胞,以2×104/cm2的密度接种进行细胞传代与分组实验。实验分2组,对照组继续用原培养液培养;实验组在原培养液基础上加入地塞米松(浓度10-7mol/L)诱导培养。两组细胞继续培养1周后,抽取总RNA进行半定量反转录聚合酶链反应分析。比较两组骨髓基质细胞中骨保护素与核因子活化受体配体基因的表达水平。骨保护素与核因子кB活化受体配体mRNA表达量用β-actin表达量来标准化。结果:①骨保护素mRNA表达水平(骨保护素/β-actin):实验组显著低于对照组犤1.21±0.12,2.05±0.11(t=10.320,P<0.01)犦。②核因子кB活化受体配体mRNA表达水平(核因子кB活化受体配体/β-actin):实验组显著高于对照组[2.53±0.14,1.17±0.19(t=11.525,P<0.01)]。③核因子кB活化受体配体/骨保护素mRNA表达水平比值:实验组显著高于对照组[2.21±0.17,0.62±0.08(t=16.925,P<0.01)]。结论:加入地塞米松后骨髓基质细胞骨保护素分子合成减少,从而减弱其对核因子кB活化受体配体-核因子кB活化受体信号轴的抑制作用,因此破骨细胞分化及骨吸收作用相对增强,导致骨重建失衡。

胆结石患者胆汁对人胆管癌细胞增殖的影响

目的:观察胆结石患者胆汁对人胆管癌细胞HCCC-9810生长的影响,探讨胆结石与胆管癌发生、发展的关系。方法:应用四甲偶氮唑蓝比色法检测18份胆结石患者胆汁和8份正常胆汁对HCCC-9810增殖的影响,应用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。结果:胆结石患者胆汁与正常胆汁比较,明显促进HCCC-9810细胞增殖,用胆结石患者胆汁处理48 h的HCCC-9810细胞增殖指数显著上升(P<0.01),胆结石胆汁组(47%±10%)S期细胞比例比正常胆汁组(23%±3%)明显增高(P<0.01),G0/G1期细胞比例(42%±8%)比正常胆汁组(63%±10%)明显降低(P<0.05)。结论:胆结石患者胆汁具有潜在的促增殖活性,胆结石与胆管癌的发生、发展关系密切。

人发角蛋白桥接周围神经缺损后的相容性和降解性的实验研究

目的探讨人发角蛋白(H H K)在桥接周围神经缺损后,诱导神经再生及与周围组织的相容和自身的降解情况。方法用聚乳酸-羟基乙酸(P LG A)套管装配H H K来桥接SD大鼠10m m长的坐骨神经缺损,术后第3、6、9、12周取材,切取中段行H E染色,并对第6周标本加行S100蛋白和神经丝(N F)免疫组化染色,12周标本横切加行透射电镜检查,做组织学观察。结果术后3周H H K毛小皮已经开始剥脱降解,并已有大量的雪旺细胞和神经纤维沿H H K长入,6周时H H K均已质化,免疫组化染色见大量的S100蛋白阳性细胞和N F阳性纤维;9、12周H H K继续降解,长入其间的雪旺细胞和神经纤维更多,排列更加规律,电镜下见已形成较厚的髓鞘板层。结论H H K具有很好的生物相容性和可控的降解速率,能很好的诱导神经再生,可作为支架材料应用于周围神经组织工程研究。

人发角蛋白材料植入修复皮下脂肪缺损的实验观察

目的 探讨人发角蛋白材料植入皮下脂肪缺损处能否形成新生脂肪组织,旨在为皮下肿物切除术后即时填充修复及矫正陈旧性体表凹陷畸形提供一条新的途径. 方法 采用西藏小型猪3只,在猪脊柱两侧皮下各形成脂肪缺损8处,直径约1.5 cm.将人发角蛋白材料制成直径约1.5 cm球状植入一侧缺损处,另一侧脂肪缺损作为空白对照.采用组织学方法观察术后不同时间人发角蛋白材料降解及新生脂肪组织生成情况. 结果 人发角蛋白材料植入后2周,可见结缔组织及微血管从材料孔隙长入;植入后4周,人发角蛋白基本降解吸收,可见材料碎屑及异物肉芽肿,其周围见成簇的新生脂肪细胞;植入后6周,人发角蛋白材料完全降解,异物肉芽肿也随之消失,代之以新生脂肪组织,其体积与当初植入的人发角蛋白材料体积接近;植入后10周,新生脂肪组织中的纤维成分减少,接近周围正常脂肪组织. 结论 人发角蛋白材料植入皮下脂肪组织缺损处,可在原位形成足够体积的新生脂肪组织,并逐渐塑形,从而在组织结构上接近正常脂肪组织.