抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体的生物学活性研究

背景与目的目前,常规疗法已难以提高卵巢癌患者的生存率,已有实验数据及临床前试验结果表明,双特异性抗体能有效介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究旨在通过检测抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-I)的生物学活性,为其临床前试验及应用提供实验依据。方法观察BHL-I介导的外周血淋巴细胞(peripheralbloodlymphocyte,PBL)与靶细胞SKOV3结合、MTT法检测外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)增殖及PBL对靶细胞SKOV3杀伤效应,ELISA法检测杀伤过程中PBL分泌hIFN-γ、hTNF-α变化。结果BHL-I介导的花环形成率(15.7%)显著高于对照组(11.1%)(P<0.01);在抗原存在下,BHL-I显著促进PBMC增殖和PBL对靶细胞的杀伤(P<0.01),且杀伤率与花环形成率呈正相关(r=0.946);杀伤过程中上清液中hIFN-γ、hTNF-α显著增高(P<0.01)。结论BHL-I能介导PBL和SKOV3结合并活化PBL特异杀伤效应,杀伤可能与其hIFN-γ、hTNF-α表达增高有关。

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的生物信息学鉴定与分析

目的鉴定日本血吸虫中存在的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,分析其蛋白结构特征。方法采用双向同源比对、结构域搜索和系统发育分析等生物信息学手段,在已有转录组和蛋白质组数据基础上鉴定日本血吸虫的腺嘌呤磷酸核糖转移酶,并采用同源建模方法获得日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶的结构特征。结果获得了2条腺嘌呤磷酸核糖转移酶的同源蛋白序列;分析了这2条序列的EST丰度、理化性质及蛋白三维结构等信息。结论日本血吸虫至少存在2个腺嘌呤磷酸核糖转移酶的异构体。

双功能分子白介素-2-粒细胞-巨噬细胞集落生长因子促进树突状细胞在肿瘤免疫抑制环境中的活化效应

目的将本室构建与制备的双功能分子白介素-2-粒细胞-巨噬细胞集落生长因子(IL2-GMCSF)蛋白作用于肿瘤条件培养基(TCM)环境中的树突状细胞系(DC),检测其对DC细胞的活化,探讨其用于活化DC、进行抗肿瘤免疫治疗的可能性。方法制备小鼠黑色素瘤B16F10细胞系的TCM,用以培养DC2.4细胞,同时分别添加IL2-GMCSF、GM-CSF、IL-2、或IL-2与GMCSF组合使用。24 h后,检测DC2.4细胞的吞噬与增殖活性、细胞成熟表型、细胞因子分泌与信号通路活化。结果 DC2.4细胞具有未成熟DC的特征,在TCM培养条件下吞噬能力增强、但增殖活性显著受抑,TCM对DC成熟表型表面标志的表达有一定促进作用,并促进单核与DC来源的趋化因子(MDC),但抑制DC的IL-12分泌。与之相反,IL2-GMCSF主要借助其GM-CSF活性,促进DC2.4细胞的吞噬与增殖活性,并促进DC进一步成熟,且高表达IL-12与MDC。与GM-CSF相比,IL2-GMCSF可诱导更高的炎性NF-κB通路活化水平,而抑制调节性STAT3通路的活化。结论与GM-CSF单独作用相比,IL2-GMCSF可更好地促进肿瘤免疫抑制环境中的DC活化,有望成为有效的临床抗肿瘤治疗手段。

IL-2体外诱导健康人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的研究

目的研究IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的影响。方法分离健康志愿者外周血T细胞,加入IL-2,常规体外培养,乳酸脱氢酶释放法检测其非特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术,分析其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果3例健康志愿者外周血T细胞对鼻咽癌细胞系CNE2没有杀伤作用;PBMC的TCRVβCDR3谱型均呈高斯分布,经IL-2体外培养后部分家族出现不同的优势表达。结论IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移有一定影响,对其非特异性杀伤无影响。

肺结核患者外周血αβT细胞CDR3谱系研究

目的探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系漂移,为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法采用基因扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCRVα和Vβ基因家族的优势取用情况,对克隆性增生T细胞CDR3区进行序列分析。结果6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα,24Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布(gaussian distribution),6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用,对部分单/寡克隆增生T细胞α,β链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论肺结核患者活动期外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关,优势取用Vα,Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定,为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。

系统性红斑狼疮患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移和序列鉴定

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移,为SLE的免疫应答机制和个性化治疗研究提供基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析5例正常献血员的CDR3分布特征及5例SLE患者PBMC中T细胞TCRβ链CDR3的优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果5例正常献血员PBMCTCRBVCDR3谱型均呈高斯分布,5例活动型SLE患者24TCRBVCDR3家族均出现不同的优势表达,对单/寡克隆性增生T细胞β链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论SLE活动期外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与SLE的免疫发病机理有关,特异应答的T细胞TCRCDR3序列的确定,将为SLE的发病机制研究和个性化治疗提供新的方法与手段。

重组腺病毒Ad-HGF转染骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的构建人肝细胞生长因子(HGF)重组腺病毒表达载体,体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),检测HGF基因表达,探讨转HGF基因的BMSCs治疗股骨头缺血性坏死(ANFH)的可行性。方法利用RT-PCR方法,从共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞株中扩增人HGFcDNA,插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生重组腺病毒Ad-HGF,PCR鉴定毒种正确后,在293细胞中扩增、纯化,TCID50法测定感染性滴度,然后感染BMSCs,RT-PCR、原位杂交、免疫组化检测转染后细胞中HGF的转录和表达。结果成功制备了Ad-HGF,感染性滴度为2.6×1010TCID50/ml,转染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达。结论获得高表达人HGF基因的BMSCs,为其用于早期ANFH的治疗奠定了基础。

医患鼻前庭携带耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与医院感染菌同源性的研究

目的探讨医院医务人员和住院患者鼻前庭带耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的相互关系和对发生与控制医院感染的影响。方法对本院发生金葡菌感染较多的某科医务人员和住院1周以上患者的鼻前庭进行采样,常规方法进行金葡菌鉴定和MRSA确认。将医患鼻前庭以及肺炎患者痰中分离出的MRSA菌株,进行随机引物扩增多态DNA(RAPD)检测,将RAPD指纹图输入凝胶成像分析系统,经计算机处理,运用RAPD软件(Quantityone4.4.0Bio-Rad)进行同源性分析。判断医患鼻前庭携带MRSA的相关性及其与MRSA医院感染的相关性。结果RAPD聚类分析,基因同源性较高的可分为5型,医患之间、患者之间鼻前庭以及3株MRSA院内肺炎与其本人鼻前庭所携带的MRSA有较高的同源性。结论MRSA在鼻前庭较的定植或携带,可通过患者、医务人员的移动发生病室内、病室间的患者之间和医患之间的传播或感染。

激素性股骨头坏死模型的建立及病理和影像学特征

目的建立兔激素性股骨头坏死动物模型,观察激素性股骨头坏死的病理及影像学特征。方法将20只健康新西兰兔随机分成两组,每组10只。A组:模型组,注射马血清及醋酸泼尼松龙造模;B组:正常对照组。采用X片及CT观察股骨头形态的变化,处死动物,标本进行常规组织病理学检查,并进行动脉墨汁灌注观察。结果X片及CT结果显示:造模组两侧股骨头密度不均一,关节面模糊;墨汁灌注血管造影显示股骨头血管显著减少;病理组织学观察结果显示:骨小梁骨细胞陷窝空疏,骨细胞核固缩,部分血管栓塞,骨髓腔内造血组织明显减少。结论马血清、激素诱导的激素性股骨头坏死动物模型病理变化、影像学改变符合临床典型股骨头坏死的特征,为进一步研究股骨头坏死发病机制及治疗方法提供基础。

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的：探讨血清1型腺相关病毒（rAAV1）介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白（GFP）的表达及转染率。方法：采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒（rAAV1-EGFP）感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型，用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h，再用此缝线间断缝合，将植片移植到大鼠角膜植床，术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果：按rAAV1-EGFP不同转染倍数（MOI）转染角膜基质细胞。转染后3d，在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达；随MOI值的增高而增强，转染再7～9d达到高峰，此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率，MOI=10^时是16．3％，MOI=10^4时是30．3％，MOI=10^5时是43．6％，MOI=10^6时是47．5％.rAA1－ECFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论：rAAV1-ECFP可以在体内外稳定、有转染大鼠角膜基质细胞，是角膜基质细胞理想的报告基因。

巨细胞病毒疾病的研究进展

巨细胞病毒(CMV)感染在免疫功能受抑制的患者中常见,而抗病毒药物的大量使用具有毒性和严重不良反应。近年来,研究者开始尝试CMV特异T细胞回输的免疫治疗,取得了一定的进展。为了更充分地了解CMV疾病的特点,现综述CMV疾病最近几年的研究进展,为今后的研究提供参考。

肝细胞生长因子基因转染5-aza诱导后的骨髓基质干细胞及其表达、分化的研究

目的将重组腺病毒(Ad-HGF)转染5-氮胞苷(5-aza)诱导后的骨髓基质干细胞(BMSCs),检测其心肌样细胞分化和HGF基因表达,探讨其用于缺血性心脏病治疗的可行性。方法以5-aza诱导比格犬BMSCs向心肌样细胞分化,形态学观察、免疫组化检测心肌样细胞标志—β-肌球重链蛋白(β-MHC)和α-横纹肌肌动蛋白的表达;以Ad-HGF转染5-aza诱导后的BMSCs,RT-PCR、ELISA检测肝细胞生长因子(HGF)的表达。结果形态学观察与免疫组化结果表明,5-aza诱导BMSCs向心肌样细胞分化,Ad-HGF转染5-aza诱导后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达,转染后48h表达量最高,达103ng/ml。结论 Ad-HGF可高效转染5-aza诱导后的BMSCs,为其应用于缺血性心脏病的生物治疗奠定了基础。

大肠杆菌表达的人血管内皮细胞生长因子的复性与纯化研究(英文)

以包涵体的形式在大肠杆菌中表达人血管内皮细胞生长因子(VEGF121) , 采用发酵罐进行工程菌的高密度发酵,得到菌干重 46 g/L, VEGF121 包涵体 4.5 g/L。包涵体经洗涤、溶解、超滤法复性, 得率为 81%。复性后的目标蛋白经离子交换色谱及 Sepharcry S-100 凝胶过滤色谱纯化, 目标蛋白的纯度达到 95%, 目标蛋白的总得率 31%。采用该工艺制备的 VEGF121 能刺激人脐静脉血管内皮细胞增殖, 具有天然 VEGF 生物学活性。

IL-2-PE66抑制大鼠角膜内皮细胞MHC抗原表达的研究

目的了解正常大鼠角膜内皮细胞在体外经γ-干扰素诱导后,组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ、Ⅱ类抗原异常表达的情况,并观察比较IL-2-PE66、环孢素A(CsA)对这种异常表达的免疫抑制作用。方法采用ACAS-570黏附式细胞分析仪和免疫荧光技术,对体外原代培养经γ-干扰素诱导的大鼠角膜内皮细胞进行MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达量的测定,并观察加入白细胞介素-2(IL-2)-PE66、CsA后,MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达量的变化。结果γ-干扰素能明显诱导大鼠角膜内皮细胞MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原异常表达,而IL-2-PE66、CsA能明显抑制这种异常表达,二者之间的免疫抑制效果无明显差异。结论IL-2-PE66及CsA均能明显抑制大鼠角膜内皮细胞在体外经γ-干扰素诱导后,MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原的异常表达。提示IL-2-PE66是一种高特异性的强效免疫毒素,是未来抗角膜移植排斥的新型基因药物。

单链双特异性抗体(BHL-I)介导的细胞毒作用及其可能机制研究

目的:观察单链双特异性抗体(BHL-I)介导的PBL对靶细胞SKOV3的杀伤作用,并研究其细胞毒作用的可能机制。方法:MTT法检测在不同效靶比、不同作用时间、不同靶细胞(SKOV3、BEL-7402)、不同BHL-I浓度等条件下,BHL-I介导PBL对靶细胞的杀伤作用;RT-PCR检测杀伤过程中PBL的穿孔素(Perforin)、颗粒酶(GranzymeB)mRNA的表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ含量变化。结果:BHL-I介导的PBL对SKOV3细胞毒作用明显高于对BEL-7402的,并且在效靶比10∶1、作用36小时、BHL-I浓度为25μg/ml时,PBL对靶细胞SKOV3的细胞毒作用最为显著;在IL-2存在下,BHL-I可引起Perforin、GranzymeB mRNA较高表达及细胞培养上清液中TNF-α、IFN-γ含量升高,当作用时间为72小时时,这些细胞因子的表达有所下降。结论:BHL-I能介导PBL对表达有相应靶抗原的SKOV3细胞具有高效杀伤作用,其细胞毒作用可能与效应细胞表达Perforin、GranzymeB、TNF-α、IFN-γ等有关。

毒品成瘾的分子基础

毒品成瘾的形成是一个循序渐进的、综合性的过程。在此过程,机体在分子、细胞学水平发生了代偿性变化,进而导致成瘾的一系列症状。中脑边缘系统多巴胺系统的激活是多种毒品成瘾的共同神经生物学特点。长期地施用毒品,可以导致机体的功能系统发生变化,即耐受性、依赖性、敏化性。上述不同的功能变化特点有其相应的分子细胞学基础。

抗CD3/抗肿瘤抗原双特异性抗体介导T淋巴细胞抗肿瘤效应与机制研究进展

双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb;称双功能抗体bifunctional antibodies)是指通过化学偶联、细胞工程(双杂交瘤细胞)和基因工程方法制备的一种能在体内外分别与两种特异抗原结合并能产生生物学效应的抗体,BsAb在肿瘤药物导向治疗、免疫学检测和介导细胞毒作用中广泛应用。通过BsAb激活免疫系统抗肿瘤治的疗研究中,发现抗CD3/抗肿瘤抗原BsAb在介导T细胞高效特异的抗肿瘤效应的同时,又可以激发机体自身产生和维持较长时间的免疫保护作用,在卵巢癌等十多种肿瘤研究中显示较好的应用前景。

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化。结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%。结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平。

两种免疫毒素抑制大鼠角膜内皮细胞MHC抗原表达的疗效比较

目的了解正常大鼠角膜内皮细胞在体外经γ-干扰素诱导后,MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原异常表达的情况,并观察比较IL-2-PE66、IL-2-PE40对这种异常表达的免疫抑制作用。方法采用ACAS-570黏附式细胞分析仪和免疫荧光技术,对体外原代培养经γ-干扰素诱导的大鼠角膜内皮细胞进行MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达量的测定,并观察加入IL-2-PE66、IL-2-PE40后,MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原表达量的变化。结果未加入γ-干扰素前,MHC-Ⅰ类抗原的表达量为97.8±8.1、MHC-Ⅱ类抗原无表达;经γ-干扰素诱导后,MHC-Ⅰ类抗原的表达量为1006.3±13.2、MHC-Ⅱ类抗原表达量为406.5±10.5,γ-干扰素加入前后MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原比较差异均有统计学意义(P<0.01)。IL-2-PE66组MHC-Ⅰ类抗原的表达量为598.2±12.5、MHC-Ⅱ类抗原表达量为197.5±6.8,IL-2-PE40组MHC-Ⅰ类抗原的表达量为618.2±13.5、MHC-Ⅱ类抗原表达量为204.5±7.8,IL-2-PE66组、IL-2-PE40组分别与注射用水比较,MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原间差异均有统计学意义(P<0.05),IL-2-PE66组与IL-2-PE40组比较,MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原间差异无统计学意义(P>0.05)。结论IL-2-PE66及IL-2-PE40均能明显抑制大鼠角膜内皮细胞在体外经γ-干扰素诱导后,MHC-Ⅰ、Ⅱ类抗原的异常表达。提示2种免疫毒素IL-2-PE66、IL-2-PE40均是高特异性的强效免疫毒素,是未来抗角膜移植排斥的新型基因药物。