基于细胞穿透肽Tat的Cre-Loxp重组酶系统的改造

目的:构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并入核实现细胞水平的基因敲除。方法:在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-SBP-Tat-EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS-Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE_3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用Ni^(2+)亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Western blot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果。结果:经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低。结论:利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除。