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人高迁移率族蛋白1的原核细胞表达及其功能研究 被引量:5
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作者 赵雷 刘靖华 +4 位作者 唐靖 李志杰 刘亚伟 邓鹏 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1119-1123,共5页
目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序... 目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-HMGB1融合蛋白,用Ni-NTA亲和树脂纯化。将纯化得到的HMGB1蛋白经透析和过滤除菌后,刺激人脐静脉内皮细胞,24h后收集培养上清,经LiquiChip液相蛋白芯片系统检测细胞因子。结果:构建的pET14b/HMGB1表达质粒经酶切和测序验证正确;表达的目的蛋白经Western blotting验证能被His抗体识别;检查了纯化的HMGB1蛋白对HUVEC产生细胞因子的影响,发现重组的HMGB1可诱导白细胞介素8(IL-8)上调,并且呈剂量依赖性关系。结论:成功构建了His-HMGB1原核细胞表达质粒并纯化得到重组的HMGB1;在HUVEC模型上证实所得到的HMGB1蛋白具有生物学活性。本实验为进一步研究HMGB1的功能提供了重要的实验材料。 展开更多
关键词 高迁移率族蛋白质类 原核表达 细胞因子类 脐静脉内皮细胞
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人高迁移率族蛋白B1细胞内定位及移位研究 被引量:11
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作者 徐佳 刘志锋 +2 位作者 王娟 邓鹏 姜勇 《中国危重病急救医学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期338-341,共4页
目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohe... 目的观察人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在真核细胞内的定位和移位情况。方法构建人HMGB1及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的哺乳动物细胞表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合表达形式克隆到带有血凝素(hytohemagglutinin,HA)标记的载体pcDNA3HA上,随后转染293A细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经酶切、聚合酶链反应(PCR)和测序鉴定证明构建正确,并在293A细胞中得到大量表达。荧光显微镜观察发现,融合蛋白主要分布于细胞核中,经肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激后18h,部分细胞中融合蛋白从胞核移位到胞质,与预期结果一致。结论HMGB1的绿色荧光蛋白融合表达载体构建成功。该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位、移位,为下一步深入研究HMGB1作用细胞的信号通路提供了一个重要的工具。 展开更多
关键词 高迁移率族蛋白B1 增强型绿色荧光蛋白 细胞内定位 载体构建
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脓毒症单核巨噬细胞特异性结合肽的筛选 被引量:6
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作者 丁宁 刘承武 +3 位作者 李志杰 刘靖华 邓鹏 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1045-1050,共6页
利用噬菌体随机肽库展示技术,筛选出与脓毒症单核/巨噬细胞特异性结合的短肽,探索脓毒症治疗的新方法.分别以经过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的人外周血单核细胞株(THP-1)细胞作为筛选的靶细胞,以未经LPS处理的THP-1细胞作为非... 利用噬菌体随机肽库展示技术,筛选出与脓毒症单核/巨噬细胞特异性结合的短肽,探索脓毒症治疗的新方法.分别以经过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的人外周血单核细胞株(THP-1)细胞作为筛选的靶细胞,以未经LPS处理的THP-1细胞作为非特异性噬菌体吸附细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮"差减"筛选,经过细胞ELISA验证阳性噬菌体克隆,对获得的阳性克隆进行DNA测序及生物信息学分析,并进一步利用免疫荧光实验,鉴定噬菌体克隆与LPS处理THP-1细胞的结合特异性.4轮筛选后,随机挑取的噬菌体克隆,测序后得到可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合肽.对去冗余后的七肽进行Clustal W多序列比对分析和BlastP蛋白同源相似性分析,细胞免疫荧光检测确定获得的噬菌体展示七肽可与LPS处理的THP-1细胞特异性结合.噬菌体随机肽库技术为脓毒症单核/巨噬细胞表面靶位的筛选提供了高效、快捷的筛选体系,实验获得的多肽基序具有高度保守性和细胞特异性,这些多肽的生物活性将是下一步的研究内容. 展开更多
关键词 单核 巨噬细胞 脂多糖 噬菌体展示 肽库 脓毒症
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维拉帕米预处理对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究 被引量:8
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作者 丁宁 王芳 +1 位作者 肖慧 王迪芬 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期1061-1064,共4页
目的观察不同时间点予维拉帕米预处理对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及寻找维拉帕米最佳预处理时间点。方法沙土鼠33只,随机分为正常对照A组(n=6)、缺血损伤B组(n=6)、维拉帕米预处理C~E组(n=7),即脑缺血前48、24、12h分别予2.5%... 目的观察不同时间点予维拉帕米预处理对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及寻找维拉帕米最佳预处理时间点。方法沙土鼠33只,随机分为正常对照A组(n=6)、缺血损伤B组(n=6)、维拉帕米预处理C~E组(n=7),即脑缺血前48、24、12h分别予2.5%维拉帕米(2mg/kg·b.w.)腹腔注射。观察指标为超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及丙二醛(MDA)、内皮素(ET)、降钙素基因相关肽(CGRP)的含量。每组随机取一大小约1mm×1mm左颞前叶脑组织,电镜观察脑组织超微结构的改变。结果维拉帕米预处理各组的GSH活性显著高于缺血损伤组(P<0.01),ET的含量显著低于缺血损伤组(P<0.05)。C、D组SOD活性显著高于B组(P<0.05),E组SOD活性高于B组,但无统计学意义;C、D组MDA含量显著低于B组(P<0.05),E组MDA含量低于B组,但无统计学意义。C、D、E各组CGRP的含量高于B组,但无统计学意义。维拉帕米预处理各组的脑组织超微结构损伤改变不大或仅有轻微的改变,而缺血组脑组织超微结构表现出严重的损伤。结论缺血前48~12h予维拉帕米预处理对沙土鼠的脑缺血再灌注损伤有不同程度的保护作用,以预先给药48h组的效果较为显著,这种作用与其增加体内抗氧化物质SOD、GSH的活性及拮抗ET的毒性有关。 展开更多
关键词 脑缺血再灌注 维拉帕米 预处理 脑保护
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细菌脂多糖识别系统 被引量:13
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作者 丁宁 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期711-717,共7页
细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可激活单核/巨噬细胞、内皮细胞合成和释放多种细胞因子,导致全身性炎症反应.LPS识别及跨膜信号转导是引起细胞效应的关键.在过去的几年中,有关LPS结合蛋白家族和受体系统及其作用机制的研究突飞猛进... 细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可激活单核/巨噬细胞、内皮细胞合成和释放多种细胞因子,导致全身性炎症反应.LPS识别及跨膜信号转导是引起细胞效应的关键.在过去的几年中,有关LPS结合蛋白家族和受体系统及其作用机制的研究突飞猛进,大量研究表明LPS识别涉及复杂的蛋白质间相互作用.在此对LPS识别系统成员及其功能的最新研究进展进行综述,并详细介绍新近提出的"LPS受体激活簇"理论. 展开更多
关键词 脂多糖 脂多糖受体 脓毒症 蛋白质-蛋白质相互作用
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p38L12-TAT融合肽对山梨糖醇引起的ECV304细胞ATF2磷酸化的抑制作用 被引量:1
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作者 郭爱华 刘志锋 +7 位作者 李海玉 唐靖 李志杰 刘亚伟 龚小卫 刘靖华 邓鹏 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期402-408,共7页
构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET1... 构建p38Loop12(L12)的TAT融合表达载体,纯化原核表达的p38L12融合蛋白并鉴定其在真核细胞内的功能.利用PCR方法分别扩增出p38L12及其“TXY”双磷酸化位点的AF突变体p38L12(AF)片段,克隆入His标记的TATEGFP融合蛋白原核表达载体pHTE(pET14bHisTATEGFP),经酶切、测序鉴定正确后,将重组质粒转化原核表达菌,诱导表达纯化融合蛋白;将融合蛋白加入ECV304细胞后于荧光显微镜下观察并行Western印迹分析,检测融合蛋白的细胞内转导活性;通过检测内源性ATF2磷酸化水平,鉴定高渗刺激下p38L12对内源性p38活性的影响.成功构建了p38L12和p38L12(AF)片段与TAT的融合表达载体,并获得相应的融合蛋白.在ECV304细胞中可见导入的HTEp38L12和HTEp38L12(AF)融合蛋白具有较高的细胞内转导活性和转导效率,并可竞争性抑制高渗刺激对内源性p38的活化.基于HIV1TAT细胞转导系统证实p38L12可竞争性抑制高渗刺激诱导的内源性p38对ATF2的活化,从而发挥对p38激活特异性抑制的功能. 展开更多
关键词 Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白 丝裂原活化蛋白 LOOP 12 细胞转导系统
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视紫质样GPCR中偶联氨基酸的变构通讯网络 被引量:2
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作者 谭小丹 卢智勇 +1 位作者 邓亲恺 姜勇 《第四军医大学学报》 CAS 北大核心 2005年第15期1435-1438,共4页
目的:预测视紫质样GPCR中由Leu125等氨基酸组成的变构通讯网络.方法:基于视紫质蛋白的多序列比对,利用统计偶联分析方法计算该多序列比对中各氨基酸位点的统计能量.然后,提取该多序列比对在Leu125氨基酸位点为异亮氨酸的序列组成子比对... 目的:预测视紫质样GPCR中由Leu125等氨基酸组成的变构通讯网络.方法:基于视紫质蛋白的多序列比对,利用统计偶联分析方法计算该多序列比对中各氨基酸位点的统计能量.然后,提取该多序列比对在Leu125氨基酸位点为异亮氨酸的序列组成子比对,根据子比对计算比对中任一位点和Leu125氨基酸位点的统计偶联能量.结果:根据此统计偶联能量推测出与Leu125偶联的氨基酸位点.结论:通过统计偶联分析推测出的与Leu125偶联的氨基酸位点为研究证实了的视紫质样GPCR中的重要功能位点,它们构成了视紫质样GPCR的变构通讯网络. 展开更多
关键词 视紫质 统计偶联分析 蛋白偶联受体 Leu-125氨基酸
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细胞穿透肽在肿瘤治疗中的应用 被引量:1
8
作者 黄劭 刘亚伟 姜勇 《生理科学进展》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期301-306,共6页
随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的... 随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的入胞转运方式如电穿孔、脂质体转染等均存在对细胞的额外毒副作用,且作用范围局限于体外实验。细胞穿透肽是一类以非受体依赖方式,非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽。它们可以与多种生物活性物质连接并携带其进入细胞,这一特性为它们成为理想的药物载体提供了可能。本文对使用细胞穿透肽作为载体转运具有抗癌作用的生物大分子进入细胞的抗癌实验予以介绍。 展开更多
关键词 肿瘤 细胞穿透多肽 跨膜转运
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应激相关的热休克信号转导通路的研究进展
9
作者 李煜生 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期1030-1035,共6页
LI Yu-sheng, JIANG Yong (Department of Pathophysiology and Key Laboratory of Functional Proteomics of Guangdong Province, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China) abtract:A lot of diseases (e.g., acute in... LI Yu-sheng, JIANG Yong (Department of Pathophysiology and Key Laboratory of Functional Proteomics of Guangdong Province, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China) abtract:A lot of diseases (e.g., acute infarction and infections) and the diversity of harmful environmental changes, including elevating temperature, heavy metals and oxidants damage many kinds of proteins in organism. The denatured proteins usually evoke endogenous adaptive cellular mechanisms called heat shock response. After the activation, heat shock factors (HSFs) bind with heat shock element (HSE). This progress induces heat shock protein (HSP) expression, then facilitates repair of misfolded proteins, and finally inhibits the cell death (both necrosis and apoptosis) pathways. This review will introduce the structures and functions of HSF, HSP and HSE and details on the signaling process of HSP regulation by HSF. 展开更多
关键词 热休克因子 热休克元件 热休克蛋白质类 信号转导
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