HPC2突变体真核表达载体的构建

目的构建在哺乳动物细胞表达的HPC2真核表达突变载体,并在U2OS细胞中表达。方法从人U2OS细胞中克隆HPC2 cDNA片段,并利用Gateway技术构建pcDNA3.2/V5/HPC2质粒。将质粒用脂质体瞬时转染U2OS细胞,细胞裂解后用Western blot分析HPC2的表达情况。设计突变引物,以HPC2质粒为模板进行PCR,将PCR产物连接并转化扩增,得到特定位点突变的pcDNA HPC2质粒。结果 PCR、酶切、测序均表明pcDNA-V5/HPC2突变质粒构建成功,并可在U2OS细胞中表达。结论成功构建了pcDNA-V5/HPC2突变真核表达载体,为研究HPC2的功能提供了有力的工具。

LPS通过调节Cdc2蛋白表达诱导HeLa细胞凋亡的研究

目的构建细胞分裂周期蛋白2(Cdc2)真核表达载体,并在P16基因缺失的肿瘤细胞HeLa细胞中表达,利用LPS诱导细胞凋亡,并探讨LPS诱导HeLa细胞凋亡的机制。方法从人U2OS细胞中提取RNA,反转录克隆Cdc2cDNA片段,利用Gateway技术构建pDEST27-Cdc2质粒。将pDEST27-Cdc2质粒瞬时转染人宫颈癌HeLa细胞,免疫印迹分析Cdc2的表达情况,并用LPS刺激,观察其对LPS引起的细胞凋亡和细胞周期的影响。结果成功构建pDEST27-Cdc2质粒,质粒酶切及测序结果完全正确。LPS刺激HeLa细胞24h后,流式细胞仪检测发现大量细胞凋亡,而转染pDEST27-Cdc2质粒的细胞凋亡率明显降低,提示Cdc2的重要作用。免疫印迹分析研究发现,LPS诱导HeLa细胞Cdc2蛋白水平下降,进一步研究发现LPS诱导HeLa细胞G2/M期阻滞,过表达Cdc2可以降低G2期细胞阻滞的发生。结论 LPS诱导HeLa细胞凋亡是由于其导致Cdc2表达下降,细胞分裂停止在G2/M期,过表达Cdc2可以阻止死亡信号诱导的细胞凋亡。